猪苓、伴生菌及蜜环菌共培养的形态学研究

本文对猪苓、伴生菌及蜜环菌两两共培养及三者共培养进行了宏观形态观察及细胞学水平上的研究。结果表明,猪苓与伴生菌共培养时,在二者之间形成一致密拮抗线,猪苓菌落表面菌丝分化产生大量菌丝束;猪苓与蜜环菌共培养时,猪苓能阻止蜜环菌菌索对其自身的进一步侵袭,互作区中的双方菌丝及菌索均停止生长;蜜环菌与伴生菌共培养时,蜜环菌能穿透整个伴生菌菌落,在伴生菌菌落下方产生大量分枝;三者共培养后,猪苓对蜜环菌的防御能力有所下降,伴生菌对蜜环菌的耐受力有所提高,蜜环菌产生的新分枝均向伴生菌一侧生长,猪苓与伴生菌之间并不形成致密拮抗线,只可见双方菌丝的白色交融区。 猪苓与伴生菌均能在蜜环菌菌索皮层上形成侵入位点。     

猪苓、伴生菌及蜜环菌共培养的形态学研究

本文对猪苓、伴生菌及蜜环菌两两共培养及三者共培养进行了宏观形态观察及细胞学水平上的研究。结果表明,猪苓与伴生菌共培养时,在二者之间形成一致密拮抗线,猪苓菌落表面菌丝分化产生大量菌丝束;猪苓与蜜环菌共培养时,猪苓能阻止蜜环菌菌索对其自身的进一步侵袭,互作区中的双方菌丝及菌索均停止生长;蜜环菌与伴生菌共培养时,蜜环菌能穿透整个伴生菌菌落,在伴生菌菌落下方产生大量分枝;三者共培养后,猪苓对蜜环菌的防御能力有所下降,伴生菌对蜜环菌的耐受力有所提高,蜜环菌产生的新分枝均向伴生菌一侧生长,猪苓与伴生菌之间并不形成致密拮抗线,只可见双方菌丝的白色交融区。猪苓与伴生菌均能在蜜环茵菌索皮层上形成侵入位点。     

猪苓与蜜环菌高亲和性组合的筛选

猪苓与蜜环菌共生亲和性是猪苓人工栽培成功的关键因素。为获得猪苓与蜜环菌的高亲和性组合,本文采用了5株猪苓菌株与4株蜜环菌菌株进行筛选。通过将猪苓菌株与蜜环菌菌株共培养,比较不同组合的生长速度、拮抗线形成情况,以及两种菌丝生长过程中形态学变化等指标,结果发现组合GU-06&AM-08生长速度最快,为3.36mm/d。GU-06和GU-07-2菌株与每株蜜环菌共培养均可产生拮抗线,共培养28d后,产生拮抗的猪苓菌丝分枝较多,可以看到菌丝束。被蜜环菌菌索侵染的猪苓菌核,切面可以明显观察到侵入猪苓菌核中的蜜环菌菌索,侵染到猪苓菌核中的蜜环菌菌索分枝较多,中空,表皮细胞细长。发生侵染现象的组合有7组：GU-04与AM-06;GU-06与AM-06,AM-08,AM-13;GU-07-2与AM-06,AM-08;GU-15与AM-06,其中以GU-06与AM-06,AM-13两组组合侵染最严重,其余组合没有发现侵染现象。综合以上共生筛选指标获得GU-06&AM-08、GU-06&AM-06、GU-07-2&AM-08以及GU-06&AM-13 4组高亲和性的组合。     

蜜环菌侵染后猪苓菌核防御结构的发生及功能

蜜环菌通过猪苓菌核表皮侵染菌核时,菌核表皮下层的菌丝具特异的拮抗反应,如细胞中有结晶颗粒出现,厚壁菌丝形成,部分薄壁菌丝有质壁分离现象。蜜环菌的侵染诱导了菌核防御结构的发生:离侵染点一定距离的部位出现由少量木质化菌丝和厚壁菌丝形成的疏松带状;蜜环菌侵入后,上述菌丝增多并紧密排列形成菌核的初级隔离腔,入侵的蜜环菌和部分菌核被隔离在腔中;在初级隔离腔形成的同时,外围的次级隔离腔开始发育。蜜环菌菌索和皮层菌丝分枝可突破初、次级隔离腔的壁,再以菌索产生的侵染带侵染菌核较外部的最后防线即三级隔离腔。本文较系统的阐述了蜜环菌侵染后菌核各防御结构的发生特点及功能。     

猪苓与蜜环菌的关系

蜜环菌Armilla riella mcllea(Vahl：Ff．)Kgtst·侵入猪苓Gri[ola umbe』zd‘4(PetsFr．)PilOt)菌核,激活了猪苓菌抵御异体侵染免疫反应的本能,猪苓菌丝细胞木质化,形成与菌核表皮结构相似的隔离腔,将蜜环菌素和部分猪苓菌丝包围。在隔离腔中蜜环菌消化分隔在腔中的猪苓菌丝,另外猪苓菌丝也可侵入或附着在蜜环菌索及侵染带细胞间隙吸收其代谢产物,猪苓菌核即可萌发出新苓正常生长。当隔离腔中的猪苓菌丝被消化后,蛮环菌生活力也减弱,解体后被猪苓菌吸收利用,隔离腔变成空腔。从广义角度看,仍可把蜜环菌与猪苓菌寄生与反寄生的营养关系概括为共生关系。     

猪苓菌丝形成菌核伴生菌的发现及应用

在野生猪苓(Grifola umbellata (Pers.) Pilát)菌核生长穴中首次分离到猪苓菌丝形成菌核所必需的伴生菌(Grifola sp.).实验证明:纯培养的猪苓菌丝不能形成菌核,但其与伴生菌共培养,无论在实验室培养基上或用树棒栽培,猪苓菌核形成很快且发育正常;伴生菌是猪苓菌丝形成菌核的关键生物因子.另外,伴生菌菌丝和猪苓菌菌丝二者形态差别较大,前者多为细长的薄壁菌丝,后者多为细胞直径较大的薄壁和厚壁菌丝.     

猪苓菌丝形成菌核伴生菌的发现及应用

在野生猪苓 (Grifolaumbellata (Pers .)Pil偄ｔ)菌核生长穴中首次分离到猪苓菌丝形成菌核所必需的伴生菌(Grifolasp .)。实验证明 :纯培养的猪苓菌丝不能形成菌核 ,但其与伴生菌共培养 ,无论在实验室培养基上或用树棒栽培 ,猪苓菌核形成很快且发育正常 ;伴生菌是猪苓菌丝形成菌核的关键生物因子。另外 ,伴生菌菌丝和猪苓菌菌丝二者形态差别较大 ,前者多为细长的薄壁菌丝 ,后者多为细胞直径较大的薄壁和厚壁菌丝。     

蜜环菌菌索形成及分支过程中钙离子流的非损伤微测

为研究蜜环菌Armillaria mellea菌索形成及分支与钙离子的关系,以菌株Armillaria mellea 541为试验材料,采用离子非损伤微测技术,对在马铃薯琼脂糖培养基(PDA)、含0.2 g/L CaCl_2的PDA和NADPH氧化酶抑制剂200μmol/L氯化二亚苯基碘鎓(Diphenyleneiodonium chloride,DPI) PDA上培养的蜜环菌菌丝及菌索顶点、菌索分支点和成熟菌索与微环境间钙离子流进行测试。结果表明:菌株A. mellea 541菌丝和菌索的生长及菌索分支均与钙离子相关。添加0.02%CaCl_2或200μmol/L DPI后,菌丝及菌索生长速度均加快,菌丝及菌索顶端钙离子内流; 0.2 g/L CaCl_2能够促进菌株A. mellea 541菌索的形成和侧向分支,菌索数量和分支数量均显著增加,成熟菌索及菌索分支处均外排钙离子; 200μmol/L DPI则抑制菌索形成及侧向分支过程。推测钙离子与活性氧可能协同调节菌索分支。试验结果为深入揭示蜜环菌菌索形成及分支的机制提供了数据支持和研究方向。     

蜜环菌对镁的耐性和富集特性

研究了镁对蜜环菌生长的影响, 蜜环菌对于镁的耐性和富集规律, 以及高浓度镁胁迫下蜜环菌的抗氧化酶的变化情况。3?15 g/L的Mg浓度对于蜜环菌菌体的生长有促进作用。Mg浓度19 g/L以上时, 蜜环菌菌体的生长受到抑制。蜜环菌的子实体形成和子实体生物量在Mg的浓度为11 g/L以下时不受影响, 超过11 g/L则子实体不能萌发。皮壳状菌丝和菌索中Mg的含量随培养基中Mg浓度的增大而增大, 培养基Mg浓度达到16 g/L后, 菌丝、菌索中Mg的含量都不再上升。子实体对Mg的富集量比菌丝体小的多, 在培养基Mg浓度在9、10 g/L时, 子实体中Mg的含量与对照组有显著差异。随着培养基中Mg浓度的提高, 菌丝和菌索POD、CAT、SOD活性都有增加, 而且菌丝与菌索之间抗氧化酶活力的差异随着培养基中Mg浓度的提高而增大。     

蜜环菌菌索分化的差异蛋白质组学研究

菌索是蜜环菌与宿主互作的组织结构,蜜环菌菌丝形成菌索的分子机制尚不清楚。本研究采用SWATH-MS^ALL非标记定量蛋白质组学技术,首次对Armillaria mellea菌丝形成菌索过程的蛋白质组学进行了系统研究。在蜜环菌菌丝和菌索中共鉴定蛋白1 724个（global FDR 1%）,定量蛋白1 179个。与菌丝相比,蜜环菌菌索差异表达蛋白640个（上调表达256个,下调表达384个）。差异表达蛋白GO注释结果表明,蜜环菌菌索分化的生物学过程较复杂,差异蛋白参与的主要生物学过程包括有机含氮化合物代谢、有机物生物合成、小分子代谢、氧化还原反应等。分子功能富集结果提示,电子转运活性的富集因子最高,而氧化还原反应的富集P值最显著,这与KEGG注释的氧化磷酸化代谢活跃的结果一致。进一步的推测分析表明,蜜环菌菌丝形成菌索可能是受到氧化应激所致,菌索的形成可能促使诸如硫氧还蛋白样等毒力蛋白和富马酸的合成和释放增多,抑制宿主免疫而有利于蜜环菌侵染和定植于宿主。因此,对差异蛋白质组的进一步研究和深入解析不仅有利于揭示蜜环菌菌索形成的蛋白分子机制,同时也具有较强的理论和现实意义。     

蜜环菌侵染后猪苓菌核防御结构的发生及功能

蜜环菌通过猪苓菌核表皮侵染菌核时,菌核表皮下层的菌丝具特异的拮抗反应,如细胞中有结晶颗粒出现,厚壁菌丝形成,部分薄壁菌丝有质壁分离现象。蜜环菌的侵染诱导了菌核防御结构的发生：离侵染点一定距离的部位出现由少量木质化菌丝和厚壁菌丝形成的疏松带状;蜜环菌侵入后,上述菌丝增多并紧密排列形成菌核的初级隔离腔,入侵的蜜环菌和部分菌核被隔离在腔中;在初级隔离腔形成的同时,外围的次级隔离腔开始发育。蜜环菌环菌和部     

蜜环菌多糖的生物合成与发酵条件的相关性

培养基的碳、氮源,ＰＨ值直接影响蜜环菌多糖的生物合成,泥炭水解液的添加量占培养基的１０％～３９％（Ｖ／Ｖ）时,对蜜环菌多糖的生物合成有促进作用。液体振范培养时,蜜环菌生长形成球形菌丝体,菌丝生物量３．４５ｇ／Ｌ,菌丝多糖（精糖）得率为０．２８４％,而静置液体培养有利于菌索形成,菌素生物量１４．０５ｇ／Ｌ,菌索多糖（精糖）得率为０．５１５％,胞外多糖的得率分别为２９．４％和８．３％     

我国蜜环菌分类单元间菌索的相互作用

蜜环菌菌索是天麻生长的主要营养来源,而蜜环菌生物种菌索之间可能存在种间相互作用,因此天麻栽培时蜜环菌种的混用可能对天麻的产量产生影响。为揭示我国蜜环菌分类单元间菌索的相互作用,以我国8个蜜环菌分类单元为研究对象,通过研究其共同培养时整体及单侧菌索的生长速率和单位长度内生长尖端个数来研究其菌索间的作用特性。结果表明：两者间相互拮抗的有CBS D-CBS F;仅有一个蜜环菌菌索未受到影响或受到协同作用的有：CBS A-CBS H中的CBS A、CBS F-CBS J中的CBS J、CBS A-CBS F中的CBS A、CBS A-CBS N中的CBS A、CBS F-CBS M中的CBS M、CBS J-CBS M中的CBS M、CBS B-CBS J中的CBS B;组合中两种蜜环菌菌索靠近侧协同生长的有：CBS A-CBS M;组合中对两者靠近的区域具有优势的有：CBS A-CBS B中的CBS B、CBS A-CBS J中的CBS J、CBS B-CBS F中的CBS F、CBS D-CBS H中的CBS H、CBS D-CBS N中的CBS N和CBS F-CBS M中的CBS F。本研究的开展为我国蜜环菌的鉴定、天麻栽培用蜜环菌种的选用提供理论指导。     

北方蜜环菌菌索生长、发育对环境氧气及土壤湿度的响应

蜜环菌属Armillaria spp.真菌是重要的植物病原菌和兰科Orchidaceae植物天麻Gastrodia elata的专性共生菌,能以菌索形式在土壤中存活和传播,因此,土壤环境变化对蜜环菌菌索生长、发育的影响,是关系天麻栽培和森林蜜环菌病害的重要过程。为了揭示蜜环菌生长发育对土壤水分和氧气的适应特征,本研究以北方蜜环菌Armillaria borealis为研究材料,设计氧气浓度5%、15%、20%和30%的4个水平与土壤湿度20%、40%、60%和80%的双因素实验,在室内24 ℃及黑暗条件下培养,观察菌索发生时间(T)、测定菌索生物量(DW)、菌索长度(L)、菌索数(Nt)、菌索分枝数(Nf)和菌索直径(AD)。结果表明,土壤湿度和氧气浓度对北方蜜环菌菌索发育和生长具有显著影响,在15%的氧气浓度和60%的土壤湿度发育最快。本研究为人工模拟蜜环菌生长发育的环境提供了部分依据,对提高天麻人工栽培的产量,揭示森林蜜环菌病害发病机制具有重要价值。     

蜜环菌对锌的耐性和富集特性

研究了锌对蜜环菌Armillaria mellea生长的影响,蜜环菌对于锌的耐性和富集特性,以及锌胁迫下蜜环菌的抗氧化酶的变化情况。结果表明,锌浓度45mg/L下对于蜜环菌菌体的生长有显著促进作用（p＜0.05）,锌浓度90mg/L以上时,蜜环菌菌体的生长受到抑制（p＜0.05）。蜜环菌的子实体萌发和子实体生物量在锌的浓度为45mg/L以下时与对照组无显著性差异（p＞0.05）,锌的浓度超过90mg/L后子实体不能萌发。培养基锌含量在270mg/L以下时,皮壳状菌丝中锌的含量随培养基中锌浓度的增大而增大。培养基锌含量在135mg /L以下时,菌索中锌的含量随培养基中锌浓度的增大而增大。随着培养基中锌浓度的提高,菌丝和菌索POD、CAT、SOD活性都有增加,PPO的活性则是先升高后降低,而且菌丝与菌索之间抗氧化酶活力有显著差异（p＜0.05）。     

一种简便的蜜环菌分离法

一种简便的蜜环菌分离法张玉方（四川省药物种植研究所,南川６４８４０８）蜜环菌（ＡｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａＱｕｅｌ）既是一种美味的食用菌,又是贵重药材天麻和猪苓赖以生长的供养菌￣［１,４］。蜜环菌的分离可用其子实体、菌索和染菌天麻作为分离材料。一...     

蜜环菌菌索生物学特性的研究

为提高榛蘑人工栽培中出菇的稳定性,对蜜环菌菌索的生物学特性进行了研究,通过在不同生长时间、环境温度、培养基质的条件下对蜜环菌菌索进行培养。试验发现,菌索会由具有活性的黄色菌索逐渐角质化变成黑色丝状菌索,为保持蜜环菌菌索的活性状态,最佳培养条件:培养时间应控制在15²3 d,最佳培养温度为恒温25℃,最佳培养基配方为PDA+麦麸+锯末。     

蜜环菌索发育的研究

利用光学和电子显徽镜对蜜环菌索的发育及其结构分化进行了较系统研究。菌索的顶端有保持细胞不断分裂的分生组织区。由此衍生的菌丝细胞组成菌索的初生结构,包括分化不明显的表皮、皮层及初生髓;初生髓细胞体积大,核同步分裂产生多核体细胞,以一个或几个核为单位在爵体细胞中分化出细长的菌丝后,可以出芽方式自母体细胞中伸出,并且一开始就有薄壁与厚壁之分,同一母体细胞中可同时产生这两类菌丝。发育后期母体细胞破裂形成菌索的髓,两类疏松菌丝分布在其中。观察了成熟菌索的结构和侧枝的形成过程。菌索侧枝起源于皮层细胞,该细胞横向分裂首先形成分枝原基,之后突破菌索壳而分化出新的菌索顶端。讨论了蜜环菌索在不同寄主中的侵染方式。     

琼脂固体培养基培养蜜环菌菌索总DNA的提取

野外采集的蜜环菌[Armillaria mellea(Vahl.ex Fr.)Quel]在提取DNA前需要分离获得纯化的菌丝体。常规液体培养获得菌丝团的方法感杂率较高,采集固体培养基表面cellophane膜上形成的菌丝则难以获得足量的DNA提取材料。蜜环菌细胞内含有大量多醣类物质,也使得蜜环菌高质量DNA的提取存在一定的困难。本研究通过改进试验,提供一个直接从琼脂固体培养基培养的蜜环菌菌索中提取高质量DNA的方法。其中样品的预先冻融处理方法可以促使蜜环菌菌索与琼脂分离;而在裂解提取缓冲液裂解材料细胞后加入1.25 mol/L KAc溶液,则有利于除去蜜环菌细胞内的多醣类物质以及残留的少量琼脂。通过琼脂糖电泳、紫外分光光度计对DNA浓度及OD值的测定、ISSR引物的PCR扩增以及酶切产物的PCR扩增等方法的检测,结果均表明该方法提取的DNA质量较好,符合进一步进行分子生物学研究的要求。     

猪苓糖苷水解酶家族基因及其差异表达

猪苓与蜜环菌建立共生关系时,猪苓菌丝会反侵染并消解蜜环菌菌索,以获取营养物质,糖苷水解酶是参与这一过程的主要酶类之一。本研究从猪苓转录数据库中获得糖苷水解酶家族基因42类、309个;其编码的糖苷水解酶蛋白含各类结构域344个,以糖苷水解酶结构域glyco＿hydro为主,共计35类173个。对猪苓糖苷水解酶进行的gene ontology (GO)功能注释结果表明,这些蛋白参与的生物学过程以物质代谢及分解过程为主,特别是多糖等大分子物质代谢;181个猪苓糖苷水解酶具有水解酶活性,这些水解酶活性呈多样性分布。与未被蜜环菌侵染的猪苓部位相比,43个糖苷水解酶基因在蜜环菌侵染的菌核部位中差异表达,编码包括glyco＿hydro＿48、cellulase和polysacc＿deac＿1等功能结构域,可能发挥水解几丁质、纤维素酶活性及免疫调节等活性,这为猪苓与蜜环菌互作关系的研究提供了候选基因及蛋白。