新疆沙湾冷泉沉积物中免培养古菌多样性初步研究

【目的】了解新疆沙湾冷泉沉积物的古菌组成及多样性。【方法】采用免培养法,液氮研磨提取冷泉沉积物总DNA,使用古菌通用引物进行16S rRNA基因扩增,构建16S rRNA基因文库。对阳性克隆进行HhaI限制性酶切分型,选出具有不同酶切图谱的序列进行测序,将所得序列与GenBank数据库中序列比对并构建16S rRNA基因系统发育树。【结果】从冷泉沉积物古菌16S rRNA基因文库中随机挑选了121个阳性克隆,共得到22个不同的可操作分类单元,BLAST结果表明全部克隆子归属于泉古菌门(Crenarchaeote)中免培养类群。系统发育分析归类为Soil-Freshwater-subsurface group和MarinegroupI,2个亚群并且各占整个文库的50%。其中40%左右的克隆子与具有无机碳和硝酸盐同化能力的泉古菌有高的相似性。此外还发现40%的克隆子与低温泉古菌类群具有很高的相似性。【结论】新疆沙湾冷泉沉积物中古菌类群多样性较低,但存有大量高度适应此低温、贫营养环境的泉古菌类群。     

西藏扎布耶盐湖细菌多样性的免培养技术分析

【目的】利用免培养技术,获得有关西藏高原高盐度、高海拔盐湖的细菌多样性认识。【方法】从西藏扎布耶盐湖沉积样品中提取微生物总DNA,利用细菌引物f530/r1492扩增16S rRNA基因,然后构建16S rRNA基因质粒文库。采用HaeⅢ和HhaⅠ两种内切酶对阳性克隆质粒DNA进行ARDRA分型分析,根据分型结果挑选克隆进行测序。得到它们的16SrRNA基因部分序列,根据获得的序列构建构建系统发育树。【结果】在系统发育树上,部分克隆(占总克隆数的57.14%)与已知细菌属归于同一分支,主要分布在γ-变形菌纲、α-变形菌纲、δ-变形菌纲、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)的23个嗜盐细菌属之中。其余的克隆为未培养序列,与前者差异很大,在进化树上形成了独立的分支。【结论】研究结果显示出扎布耶茶卡湖中的细菌组成具有极其丰富的多样性。     

引物应用策略：基于2对古菌16S rRNA基因通用引物对环境样品古菌多样性分析

【目的】找到适宜的16S rRNA基因通用引物应用策略,应对复杂环境微生物多样性调查,尤其目前高速发展的高通量测序技术带来的巨大挑战。【方法】用Oligocheck软件分别将两对应试的古菌16S rRNA基因通用引物与RDP(Ribosomal database project)数据库中古菌16S rRNA基因序列进行匹配比对。用两对应试引物分别构建海洋沉积物样品的古菌16S rRNA基因文库。【结果】软件匹配结果显示引物f109/r958与目的基因的匹配程度高于引物f21/r958。该结果与古菌16S rRNA基因文库RFLP分析、古菌多样性指数分析结果相吻合。数据还表明,2对引物的综合文库能更好满足该沉积物样品的古菌多样性分析。【结论】选用与数据库中目的基因匹配性高的通用引物和多个引物的联合使用,可以有效提高环境样品微生物多样性调查的分辨率。     

新疆红井子盐碱土壤非培养放线菌多样性

【目的】研究新疆红井子盐碱土壤中的放线菌物种多样性。【方法】应用基于16S rRNA基因序列系统发育分析的免培养方法进行放线菌物种多样性分析。利用放线菌特异性引物,以土壤样品总DNA为模板,扩增16S rRNA基因,构建16S rRNA基因克隆文库,并对文库中的插入序列进行RFLP分析。【结果】随机挑选的246个阳性克隆通过酶切筛选出61个不同图谱的重组克隆并测序。分析结果显示这61个克隆序列分属于42个OTUs,分布于放线菌纲(Actinobacteria)的放线菌亚纲(Actinobacteridae)、酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)和红色杆菌亚纲(Rubrobacteridae);该环境中有71.4%的序列与已有效发表菌株的序列相似性小于97%,代表着放线菌新类群,其中部分序列形成了几个独立的进化分支,可能代表更高级的新分类单元。【结论】红井子土壤中的放线菌组成具有丰富的多样性,并有新放线菌分类单位的潜在资源,值得进一步进行开发研究。     

湛江海水虾池免培养蛭弧菌类生物的多样性

摘要:【目的】揭示湛江地区海水虾池蛭弧菌类生物(Bdellovibrio-and-like organisms,BALOs)多样性特点,为了解BALOs在虾池生态系统中的作用与合理应用其防治养殖对虾细菌病害提供基础。【方法】从8个热带海水虾池采集水样,提取总DNA,利用BALOs科特异引物对水样总DNA进行扩增,通过构建16S rRNA基因克隆文库与系统发育分析,对虾池水体BALOs多样性和种群结构进行研究。【结果】从嗜盐噬菌弧菌科(Halobacteriovoracaceae)和吞菌弧菌科(Peredibacteraceae)克隆文库中分别获得726个和664个有效克隆子,在16S rRNA基因序列99.5%相似性水平上分别划分为68和44个OTUs(operational taxonomic units)。在16S rRNA基因序列97%相似性上,嗜盐噬菌弧菌可划分为37个种群,且绝大多数属于未培养型,但仅有的5个可培养类群占总文库克隆数量43.5%,其中可培养类群IX 和未培养类群B28分别是最优势和次优势者;吞菌弧菌文库共包含28个种群,未培养类群pa12最为优势,唯一可培养类群A3.12是第2优势者。嗜盐噬菌弧菌与吞菌弧菌多样性大小随盐度高低呈相反趋势,但两者合起来的总BALOs 多样性大小在不同虾池间则比较接近。【结论】湛江地区海水虾池中普遍存在高度多样的嗜盐噬菌弧菌和吞菌弧菌种群,盐度显著影响虾池BALOs种群结构组成。     

基于高通量测序的花马盐湖原核微生物及其耐盐基因

【目的】揭示陕北花马盐湖沉积物原核微生物群落组成,并分析其潜在的耐盐功能基因。【方法】构建盐湖沉积物宏基因组16S r RNA文库和fosmid文库,利用Illumina HiSeq高通量测序及生物信息技术分析细菌古菌群落组成和耐盐菌株(5-5)外源宏基因组的潜在耐盐基因。【结果】获得18978条有效的16Sr RNA序列,共5221个OTUs,包括23个门,155个属,其中广古菌门(Euryarchaeota)和变形菌门(Proteobacteria)为优势菌门,盐杆状菌属(Halorhabdus)、盐红菌属(Halorubrum)及假单胞菌属(Pseudomonas)等16个属为优势属,以及嗜盐单胞菌属(Halomonas)、冷弯菌属(Psychroflexus)及不动细菌属(Acinetobacter)等139个属为非优势属。从4126个fosmid文库菌株中筛选出37株耐盐菌株,其中菌株5-5、2E4和2F4对不同浓度的NaCl、CuSO_4、ZnSO_4及CdSO_4具有耐受性,从5-5的外源宏基因组序列中获得61个Unigene,其中12个Unigene的同源基因编码的蛋白质如无机焦磷酸酶、转座酶、亚碲酸钾抗性蛋白及钙调蛋白等广泛参与其他生物的耐盐逆境。【结论】盐湖沉积物中蕴藏着丰富多样的细菌古菌类群以及潜在耐盐功能基因资源。     

九龙江河口区nirS型反硝化细菌多样性及系统发育学分析

【目的】结合16S rRNA基因克隆文库和nirS基因克隆文库的分析,揭示九龙江河口区nirS型反硝化细菌多样性。【方法】选取九龙江河口区一富营养化采样点,分别采集水样及沉积物样品,进行理化因子的测定并提取细菌总DNA。以水样DNA构建16S rRNA基因克隆文库,以沉积物DNA构建nirS基因克隆文库,分析微生物群落结构的多样性并构建系统发育树。【结果】从16S rRNA基因克隆文库中获得86条有效序列,按97%的序列相似性划分为53个OTU,分别属于Proteobacteria门、Planctomycetes门、Bacteroidetes门、Actinobacteria门、Firmicutes门和Chloroflexi门。其中属于Proteobacteria门OTU的克隆子占克隆数的62.9%,是最优势的类群,分属于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria纲等。从nirS基因克隆文库中获得190条有效序列,翻译为氨基酸序列后,按82%的序列相似性划分为60个OTU,并定位到属的水平。其中Proteobacteria门是最优势的类群,占文库克隆子总数的71.6%,包括Alphaproteobacteria纲(5.8%)、Betaproteobacteria纲(49.0%)和Gammaproteobacteria纲(16.9%)。nirS基因克隆文库中丰度最高的OTU与GenBank中的一株可培养反硝化菌Thauera sp. R-26906具有100%的序列相似性。【结论】九龙江河口区的微生物以及亚硝酸盐还原酶基因(nirS)具有丰富的多样性。大部分NirS序列在GenBank中的最相似序列来源于河口、海湾等相似的环境。     

新疆断裂带含硫冷泉泉水细菌群落结构多样性

摘要：【目的】为了解新疆断裂带含硫冷泉泉水中细菌群落结构的组成和物种多样性。【方法】采用免培养法直接从冷泉水中提取环境总DNA,采用细菌通用引物对泉水中细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增,构建16S rRNA基因克隆文库。使用限制性内切酶Hae Ⅲ对随机挑选的阳性克隆子进行限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),选出具有不同酶切图谱的序列进行测序、BLAST比对和构建16S rRNA基因系统发育树。【结果】共从细菌16S rRNA基因文库中筛选了228个阳性克隆,RFLP分型得到33个不同的操作分类单元 (Operational Taxonomic Unites, OTUs),覆盖度 (Coverage C) 为92%。BLAST比对、RDP归类及系统发育分析将这33个OTUs归为：变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门 (Bacteroidetes) 和厚壁菌门 (Firmicutes)。变形菌门为绝对优势类群,占整个细菌克隆文库的98%,,其中20%左右的类群与硫化物代谢相关的光合自养和化能自养类群纯培养菌具有高的相似性 (>97%)。此外,还发现大量类群 (总文库的64%,其中57%为军团菌属Legionella spp., 类群)与GenBank中已存细菌16S rRNA基因相似性小于96%。【结论】新疆断裂带含硫冷泉泉水中细菌类群的多样性较低,但可能存在大量潜在细菌新种和新分类。另外,该泉水可能是潜在的新军团菌病传播源,因而可能对下游人畜健康存在潜在威胁。     

新疆两盐湖可培养极端嗜盐菌组成及功能多样性研究

【目的】通过分析不同成盐类型盐湖中的极端嗜盐菌群落组成差异,探究可培养极端嗜盐菌的功能特性。【方法】采集新疆硫酸盐型盐湖七角井和碳酸盐型盐湖南湖的土壤样品,通过平板稀释涂布法分离极端嗜盐菌,经过形态学观察、特征分析获取代表菌株,通过耐盐性测定和16S rRNA基因序列测序等对代表菌株进行鉴定,并对极端嗜盐菌的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和酯酶活性进行筛选,同时检测苯酚降解能力。【结果】本研究共获得1 679株极端嗜盐菌,代表菌株45株,隶属于5门14个属,古菌数量(70.58%)明显多于细菌,最优盐浓度生长范围为18.4%–20.0%。在属水平上,盐湖中优势类群为古菌的Haloterrigena属(32.94%)和Natrialba属(26.03%),以及细菌的Aquisalimonas属(9.85%)和Aliifodinibius属(8.10%)。两盐湖中,盐度较低的南湖物种丰富度高于七角井盐湖,古菌物种组成相似,均以Haloterrigena属为主;细菌群落组成有差异,南湖以Aquisalimonas属为主,而七角井以Aliifodinibius属为主。功能筛选表明,盐湖中80%的嗜盐...     

艾丁湖沉积物放线菌多样性

摘要: 【目的】为了研究新疆艾丁湖低海拔、高盐环境中的放线菌多样性。【方法】本研究应用基于16S rRNA基因序列系统发育分析的免培养方法和选择性分离培养方法相结合的方式对艾丁湖沉积物样品进行放线菌多样性分析。利用放线菌特异性引物扩增16S rRNA 基因并构建了16S rRNA 基因克隆文库,对文库中的插入序列进行RFLP( Restriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性) 分析。采用不同盐浓度的9 种选择性培养基分离样品中的放线菌。【结果】通过对     

南美白对虾养殖底泥中氨氧化细菌与氨氧化古菌多态性分析

【目的】本研究皆在了解虾养殖底泥中氨氧化细菌与氨氧化古菌群落多态性。【方法】以功能基因为基础,构建氨氧化细菌(AOB)与氨氧化古菌(AOA)的氨单加氧酶α亚基基因(amoA)克隆文库。利用限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)技术将克隆文库阳性克隆子进行归类分析分成若干个可操作分类单元(Operational Taxa Units,OTUs)。【结果】通过序列多态性分析,表明AOB amoA基因克隆文库中所有序列都属于变形杆菌门β亚纲(β-Proteobacteria)中的亚硝化单细胞菌属(Nitrosomonas)及Nitrosomonas-like,未发现亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)。AOA amoA基因克隆文库中只有一个OTU序列属于未分类的古菌(Unclassified-Archaea),其余序列都属于泉古菌门(Crenarchaeote)。AOA群落结构单一且存在一个绝对优势类群OTU3,其克隆子数目占克隆文库的57.45%。AOB和AOA amoA基因克隆文库分别包括13个OTUs和9个OTUs,其文库覆盖率分别为73.47%和90.43%。AOB amoA基因克隆文库的Shannon-Wiener指数、Evenness指数、Simpson指数、Richness指数均高于AOA。【结论】虾养殖塘底泥中存在氨氧化古菌的amoA基因,且多态性低于氨氧化细菌,表明氨氧化古菌在虾养殖塘底泥的氮循环中可能具有重要的作用。     

黑胸散白蚁（Reticulitermes chinensis Snyder）肠道共生古菌的系统发育分析

摘要：【目的】利用非培养法对黑胸散白蚁（Reticulitermes chinensis Snyder）肠道共生古菌进行系统发育分析。【方法】采用古菌16S rDNA通用引物以黑胸散白蚁全肠DNA为模板扩增共生菌的16S rDNA并建立基因文库,对得到的基因序列进行系统发育分析。【结果】从黑胸散白蚁肠道得到5个不同的16S rDNA序列,它们之间的相似性为93.2%～99.2%,系统发育分析表明这5个16S rDNA序列代表的克隆分别与来源于黑胸散白蚁近缘种,栖北散白蚁和北美散白蚁肠道中的甲烷短杆菌克隆或     

晋南牛瘤胃中古菌分子多样性的研究

采用3对古菌特异性引物扩增瘤胃古菌16S rRNA基因分别建立克隆库来研究晋南牛瘤胃古菌的多样性.每个克隆库随机挑选100个克隆.引物Arch f364/1386建立的克隆库中,克隆分为四类,分别与四种甲烷短杆菌1Y(61%)、SM9(23%)、NT7(14%)和AK-87(2%)相似.引物1Af/1100Ar建立的克隆库中,克隆分为两类,分别与Methanobacterium aarhusense(72%)和Methanosphaera stadtmanae DSM 3091(28%)相似.引物Met86F/Met1340R建立的克隆库反映的古菌种类较为全面,除以上4种甲烷短杆菌(所占比例分别为47%、26%、11%和3%)外,还有Methanomicrobium mobile(2%)、以及类似Methanobacterium aarhusense(1%)和Methanosphaera stadtmanae(3%)的序列,还有7%的未匹配序列.系统进化分析表明,这些克隆属于Methanobrevibacter、Methanobacterium、Methanosphaera、Methanomicrobium,和未知广域古菌等5个分支.有25类属于广域古菌的未知序列,提示瘤胃中存在大量的未知产甲烷菌.     

硝尔库勒湖沉积物中非培养放线菌多样性

[目的]认识和了解盐湖沉积环境中放线菌的多样性,为今后的开发和利用奠定基础.[方法]应用免培养技术和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对新疆硝尔库勒盐湖沉积物中放线菌的多样性进行了研究.实验采用SDS-CTAB法提取土样中总DNA,利用放线菌特异性引物对土样总DNA进行16S rRNA基因扩增,并构建16S IRNA基因克隆文库;对随机挑选的160个克隆通过酶切筛选出51个不同图谱的重组克隆,并对其测序.[结果]所获得的51个克隆序列属于39个OTUs,其中52.9%的克隆序列分布于放线菌门(phylum Actinobacteria)放线菌亚(Actinobacteridae)的5个亚目和酸微菌亚纲(Acidimicrobidae)中,并且在这两个亚纲中有大量克隆序列属于放线菌的新类群,另外47.1%的克隆序列以极高的自展值在放线菌门内支持形成一个独立的大分支,极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类群.[结论]这些研究结果说明硝尔库勒盐湖中存在有较为丰富的放线菌系统发育多样性,并且潜藏着新类型的放线菌资源.     

Bacterial diversity in rock varnish of extreme arid region of Turpan Basin

The bacterial community composition and diversity in rock varnish of Turpan Basin were investigated by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and clone library of the 16S rRNA gene. 114 positive clones were screened, which could be grouped into 28 phylotypes and then further divided into 23 different operational taxonomic units (OTUs). These were affiliated into 5 phyla (Acidobacteria, Proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes and Cyanobacteria). Clones from actinobacteria were the dominant, accounting for 67.5% of total clones in the library, followed by Proteobacteria (15.8%), Chloroflexi (13.2%), Firmicutes (2.6%) and Cyanobacteria (0.9%). Rubrobacter (accounts for 35%) in the phylum Actinobacteria was the dominant genus and contained many species which might be resistant to gamma radiation. A 70% of the library clone sequences showed less 97% similarity to 16S rRNA gene sequences of standard strains obtained by pure culture. Shannon–Wiener index value of this study is 2.52 and is lower than deep-sea sediments, soils, lakes and other environments. Results of this study showed that bacterial diversity in rock varnishes of Turpan Basin was low, but maybe exist a large number of new unknown taxons, especially species that could well adapted to drought and resist radiation.     

Diversity and community structure within anoxic sediment from marine salinity meromictic lakes and a coastal meromictic marine basin, Vestfold Hilds, Eastern Antarctica

16S rDNA clone library analysis was used to examine the biodiversity and community structure within anoxic sediments of several marine-type salinity meromictic lakes and a coastal marine basin located in the Vestfolds Hills area of Eastern Antarctica. From 69 to 130 (555 total) 16S rDNA clones were analysed from each sediment sample, and restriction fragment length polymorphism (RFLP) and sequence analysis grouped the clones into 202 distinct phylotypes (a clone group with sequence similarity of > 0.98). A number of phylotypes and phylotype groups predominated in all libraries, with a group of 10 phylotypes (31% of clones) forming a novel deep branch within the low G + C Gram-positive division. Other abundant phylotypes detected in several different clone libraries grouped with Prochlorococcus cyanobacteria, diatom chloroplasts, delta proteobacteria ( Desulfosarcina group, Syntrophus and Geobacter / Pelobacter / Desulphuromonas group), order Chlamydiales (Parachlamydiaceae) and Spirochaetales (wall-less Antarctic spirochaetes). Most archaeal clones detected (3.1% of clones) belonged to a highly diverged group of Euryarchaeota clustering with clones previously detected in rice soil, aquifer sediments and hydrothermal vent material. Little similarity existed between the phylotypes detected in this study and other clone libraries based on marine sediment, suggesting that an enormous prokaryotic diversity occurs within marine and marine-derived sediments.     

Genetic Diversity of Eukaryotic Microorganisms in Lake Taihu,a Large Shallow Subtropical Lake in China

We investigated the genetic diversity of eukaryotic microorganisms (0.8-20 mum) by sequencing cloned 18S rRNA genes in six genetic libraries constructed from six locations in Lake Taihu, a large shallow subtropical lake in China. Genetic libraries of eukaryotic ribosomal RNA were screened by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, and one clone representative of each RFLP pattern was partially sequenced. A total of 528 clones were clustered into 165 RFLP patterns and finally into 131 operational taxonomic unit (OTUs). Phylogenetic analysis revealed that each library included many unique OTUs, as well as members of distantly related phylogenetic groups. A majority of the clones were from alveolates, stramenopiles, cercozoa, cryptophytes, chlorophytes, and fungi, with members of choanoflagellida, euglenida, centroheliozoa, ancyromonadidae, ichthyosporea, and kathablepharid representing a minor fraction of the library. Six OTUs (15 clones) were not related to any known eukaryotic group. Canonical correspondence analysis suggested that the differences in eukaryotic microorganism community composition of in the six regions were partially related to trophic status, sediment resuspension, and top-down regulation by metazooplankton.     

新疆沙湾冷泉沉积物的细菌系统发育多样性

为了解新疆沙湾冷泉沉积物的细菌群落组成与类群多样性,利用免培养方法直接从沙湾冷泉沉积物中提取环境总DNA,构建细菌16S rRNA基因文库。对随机挑选的241个细菌阳性克隆子进行HaeIII酶切分型得到86个可操作分类单元(OTUs),系统发育分析将其归为11个门:放线菌门(Actinobacteria),酸杆菌门(Acidobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),绿菌门(Chlorobi),蓝细菌门(Cyanobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),芽单胞菌门(Gemmatimonadetes),硝化螺旋菌门(Nitrospirae),变形菌门(Proteobacteria),浮霉菌门(Planctomycetes),疣微菌门(Verrucomicrobia)。其中酸杆菌门和变型菌门为优势类群,分别占细菌克隆文库的48%和25%。超过1/3的OTUs序列与GenBank中已存序列具有较低相似性(相似性小于95%)。此外20%左右的克隆子与固氮细菌和硝酸盐氧化细菌相关。研究结果表明,新疆沙湾冷泉沉积物中细菌种类丰富,代谢类型多样而且存在大量未知类群。