棉花粉蚧热休克蛋白基因的鉴定

热休克蛋白(heat shock proteins,Hsps)是生物体或细胞受到热胁迫后新合成的一类遗传上高度保守的蛋白,在昆虫应对外界环境因子胁迫时起着重要作用。为了系统研究棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis Hsp基因家族,对棉花粉蚧转录组基因注释信息进行分析、获得目标序列,并应用NCBI上Blast X等软件进行比对、共鉴定出24条热激蛋白(Hsp)基因,包括3个Hsp90、8个Hsp70、2个Hsp60和11个s Hsp(small heat shock protein,s Hsp)基因。对棉花粉蚧与模式昆虫家蚕Bombyx mori、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、赤拟谷盗Tribolium castaneum系统进化关系分析显示,昆虫的小分子量热休克蛋白s Hsp具有很强的种属特异性,Hsp70家族的保守性比s Hsp强。棉花粉蚧热激蛋白基因的鉴定为深入研究该虫Hsp与生长发育、抗逆境的相互关系奠定了基础。     

韭菜迟眼蕈蚊热休克蛋白BoHsp70的克隆及热胁迫下的表达分析

[目的]本研究旨在克隆韭菜眼蕈蚊Bradysia odoriphaga热休克蛋白Hsp70基因,并对其进行序列和表达模式分析,以及探讨该基因在韭菜迟眼蕈蚊生长发育及响应温度胁迫方面的作用.[方法]选择韭菜迟眼蕈蚊温度转录组中高温下表达上调的Hsp70序列,设计其基因引物扩增序列,构建qRT-PCR检测体系分析该虫在短时高温热激(30、32、34和36℃;1、2、4、6、8、10和12 h)和高温热激后不同恢复时间(25℃;1 h、2 h)下的Hsp70表达谱.[结果]获得韭菜迟眼蕈蚊Hsp70基因cDNA全长序列并命名为BoHp70(GeneBank登录号:MW250640),包含1 971 bp的开放阅读框,编码656个氨基酸,具有真核生物Hsp70基因家族的3个保守序列,同时在C-末端具有KDEL序列,推测其属于内质网型热休克蛋白.BLAST分析和氨基酸序列系统发育分析结果显示,韭菜迟眼蕈蚊与双翅目蝇类昆虫Hsp70聚类为一个分支.BoHsp70在韭菜迟眼蕈蚊体内不同发育阶段中都有表达,雄成虫体内的表达量高于雌成虫,且在雌雄成虫头部表达量的差异显著.高温胁迫可诱导BoHsp70表达,并在诱导1-2 h内达到最高水平.在30、32和34℃热激条件下随热激时间的增加,BoHsp70表达量呈下降趋势,而在36℃热激下, BoHsp70表达水平不变.韭菜迟眼蕈蚊在解除高温热激后,BoHsp70表达水平随着恢复时间的增长而下降.[结论]韭菜迟眼蕈蚊可以通过调节体内Hsp70的表达来应对不良的环境温度.     

棉花粉蚧化学感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表达谱分析

本研究克隆出了棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley化学感受蛋白(CSPs)基因Ps CSP10的全长c DNA(Gen Bank登录号:KT958555),其核苷酸序列长640 bp,编码128个氨基酸,预测其成熟蛋白分子量14.99 k D,等电点6.61,且含有4个保守的半胱氨酸,符合昆虫CSPs的典型特征。该基因编码的氨基酸序列和其他昆虫化学感受蛋白基因编码的氨基酸序列相似性为50%-56%。应用Real-time PCR测定的结果表明棉花粉蚧各发育阶段中Ps CSP10均有表达,但在雄成虫中的相对表达量显著高于其他发育阶段。在分别用扶桑Hibiscus rosa-sinensis L.、棉花Gossypium hirsutum L.、马缨丹Lantana camara L.饲养获得的雄成虫中Ps CSP10相对表达量不存在差异。研究结果为进一步明确棉花粉蚧中Ps CSP10的功能奠定了基础。     

柑橘全爪螨热激蛋白基因PcHsp90的克隆及表达模式分析

【目的】研究热激蛋白基因Hsp90在柑橘全爪螨Panonychus citri生长发育及响应高温和低温胁迫方面的作用。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆柑橘全爪螨Hsp90基因cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因的序列特性;运用荧光Real-time PCR技术,分析Hsp90基因mRNA在该螨各发育阶段、高温及低温胁迫条件下的表达模式。【结果】克隆鉴定出柑橘全爪螨一条Hsp90基因的c DNA全长序列,命名为PcHsp90(Gen Bank登录号:GQ495086),全长为2 763 bp,包含2 193 bp的开放阅读框,编码730个氨基酸,编码蛋白质的理论分子量和等电点分别为83.85kDa和4.99,氨基酸序列包括Hsp90家族的5个特征基序及细胞质型Hsp90的特征序列"MEEVD"。系统进化分析表明,PcHsp90与朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的Hsp90首先聚为一支,然后再与肩突硬蜱Ixodes scapularis的Hsp90聚合,说明它们较近的亲缘关系。PcHsp90在柑橘全爪螨的各发育阶段均有所表达,其中在幼螨期表达量较低,且显著低于若螨和成螨期的表达水平(P=0.015)。0~10℃低温胁迫下,Pc Hsp90的mRNA相对表达量无显著变化(P=0.492);但在35~41℃高温胁迫下,Pc Hsp90的mRNA相对表达量随胁迫温度的升高而上调,尤其是当温度升高到41℃时,mRNA相对表达量达到对照(25℃)的6.75倍,且差异达显著水平(P=0.007)。【结论】柑橘全爪螨PcHsp90不仅对该螨的生长发育具有重要作用,而且是其响应高温胁迫的重要机制之一。     

Molecular cloning, prokaryotic expression and expression at different developmental stages of cathepsin B gene in mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley ( Hemiptera: Pseudococcidae)

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢过程中发挥重要作用.本研究利用RACE技术克隆了扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley组织蛋白酶B基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为PsCb(GenBank登录号:JQ727999).生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框包含927 bp的片段,编码308个氨基酸.多序列比对表明,该基因编码的蛋白在N端变异较大,在C端保守性高.组织蛋白酶B基因的系统进化树结果表明扶桑绵粉蚧组织蛋白酶独自成为一支.原核表达电泳检测到一条大约35 kDa的目的条带,与预测的蛋白分子量相符.组织蛋白酶B基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达,卵期表达量相对较低,2龄若虫期达到最高峰,然后下降.本研究为进一步研究该基因的功能并开发出组织蛋白酶抑制剂,从而研制出扶桑绵粉蚧杀卵剂和胚胎发育抑制剂等提供理论依据.     

灰飞虱热激蛋白Hsp90基因的克隆、序列分析与表达模式

【目的】灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallén)是水稻上的重要害虫,它严重影响了水稻的产量和品质,特别由其传播的水稻条纹叶枯病毒对水稻的危害甚至更为严重。灰飞虱分布广,对环境有很强的适应性。本研究旨在探讨灰飞虱对温度胁迫适应的分子机制进行了初步的探讨。【方法】本研究采用RT-PCR与RACE技术克隆了热激蛋白Hsp90基因的全长,利用各种生物信息方法分析了该热激蛋白的特征,实时荧光定量PCR技术用于研究Hsp90基因在不同生长发育阶段和不同温度条件下表达变化规律。【结果】我们获得一条Hsp90 基因的cDNA全长序列,命名为LsHsp90（GenBank登录号为KF660250）。 LsHsp90全长为2 740 bp,编码729个氨基酸,等电点为5.0,分子量为83.7 kDa。氨基酸序列中含有 Hsp90蛋白家族的5个签名序列及胞质特征序列 MEEVD。结构预测表明LsHsp90具有Hsp90蛋白家族典型的结构特征。系统进化关系分析表明它与多种昆虫的Hsp90序列有较高的同源性。不同发育阶段的灰飞虱体内LsHsp90表达水平处于动态的变化过程中,并在4龄若虫期达到最大值,最低表达量在其雌成虫阶段。不同性别的灰飞虱成虫体内LsHsp90表达量有显著差异（P =0.008）。高温和低温胁迫都可以诱导灰飞虱体内LsHsp90的表达,最大的表达量分别在 40℃和-9℃。在40℃下处理不同时间后发现,LsHsp90的表达水平在处理后0.5 h时最高,但随着时间的延长,LsHsp90的表达水平逐渐降低。而在-4℃下,LsHsp90的表达水平在处理后1 h时达到最大值。【结论】灰飞虱体内的LsHsp90可以响应温度的诱导,它可能在灰飞虱温度胁迫适应过程中起到重要的作用。     

番茄热激蛋白90的全基因组鉴定及分析

热激蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是植物应对不良环境胁迫产生的一类特定的抗逆蛋白。文章以番茄(Solanum lycopersicum L.)基因组数据为平台,借助生物信息学方法对Hsp90基因家族进行鉴定与分析。结果表明,番茄至少含有7个Hsp90基因,不均匀分布在6条染色体上,氨基酸序列长度为267~794aa,内含子数目为2~19;共线性分析发现两对基因(Hsp90-1和Hsp90-3,Hsp90-5和Hsp90-7)以片段重复形式存在。MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)分析显示,番茄Hsp90基因编码的氨基酸序列具有多个保守基序;聚类分析揭示番茄、水稻(Oryza sativa L.)和拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)Hsp90基因可以分为5组,存在3对直系同源基因和4对旁系同源基因;基于RNA-seq数据库表达分析发现,3个基因(Hsp90-5、Hsp90-6和Hsp90-7)在营养器官和生殖器官中表达量较高,4个基因(Hsp90-1、Hsp90-2、Hsp90-3和Hsp90-4)除在番茄转色后10 d的果实中表达量较高外,其余组织中表达量均较低;对Hsp90基因启动子序列进行分析,发现了多个参与植物对逆境胁迫的顺式作用元件,如HSE、CCAAT-box。此外,qRT-PCR检测结果表明,在叶片热胁迫条件下,番茄Hsp90基因的表达量均存在增强趋势,表明这些基因参与了番茄叶片应对高温胁迫的反应。研究结果为鉴定番茄Hsp90基因的功能和进化起源奠定了基础。     

大螟HSC70基因克隆及表达模式分析

【目的】近年来,大螟Sesamia inferens (Walker)对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的重要害虫之一。随着全球气候变暖,大螟的分布区域也在逐渐向北延伸。HSP70家族作为分子伴侣参与生物生长发育并对外界刺激产生响应,对生物功能蛋白质的正确折叠及其转运有着重要意义。本研究旨在明确HSP70家族HSC70基因在大螟不同组织、不同发育阶段以及低温胁迫下的表达差异,初步探讨大螟对环境适应的分子机理。【方法】应用RT-PCR及RACE技术从大螟5龄幼虫中克隆得到HSC70基因;进行基因组验证,得到其基因组序列,分析内含子的位置及大小;应用实时定量PCR技术分析大螟HSC70基因的表达模式。【结果】大螟HSC70基因长2 160 bp,命名为Sihsc70（GenBank登录号：KJ639908）,开放阅读框长1 962 bp,编码653个氨基酸,推测分子量为71.6 kDa。其氨基酸序列中含有3个HSP70家族保守序列,在C-末端存在细胞质定位信号,说明大螟HSC70是细胞质热激蛋白家族成员。大螟HSC70基因组序列长度为3 522 bp（GenBank登录号：KJ639909）,含有2个内含子,长度分别为685 bp（位于编码区上游）和803 bp（位于编码区内）。在大螟5龄幼虫的不同组织中Sihsc70表达量差异不显著（P＞0.05）,其中在中肠、后肠和体壁中的表达量较高,在唾腺中的表达量最低;在大螟不同发育阶段中,Sihsc70的表达量在雌成虫最低,较高的3个阶段依次为卵、2龄幼虫和5龄幼虫,分别为雌成虫表达量的6.33,3.21和1.86倍;相对于对照组（27℃）,低温胁迫对大螟5龄幼虫HSC70基因表达的影响差异不显著（P＞0.05）。【结论】结果说明,大螟HSC70基因在不同发育阶段和幼虫不同组织中具有不同的表达水平,而低温胁迫不能诱导该基因大量表达。     

两种入侵粉虱热激基因Hsp70的克隆及温度胁迫下的种间差异表达

为了检测B型烟粉虱和温室白粉虱在受到温度胁迫时热激基因Hsp70的差异表达谱,克隆了2种粉虱Hsp70基因的全长cDNA序列,并用实时定量PCR的方法分析了在不同温度条件下该基因的表达谱。结果表明:B型烟粉虱和温室白粉虱的Hsp70基因BTH-sp70和TVHsp70(GenBank登录号分别为DQ093385和EU861391),在5’-非编码区(UTR)中有类似TATA-box样元件;在3’-UTR中有poly(A)信号AATAA和富含A-T区;根据基因开放阅读框序列(ORF)推导的氨基酸序列均含有全部3个Hsp70蛋白家族高度保守的基序。在整个检测的温度范围内(-19℃～46℃),诱导温室白粉虱Hsp70表达的起始温度(Ton)或最大温度(Tmax)要比B型烟粉虱低2.5℃～7.5℃。这些结果表明,所克隆的基因属于有功能的温度诱导型Hsp70基因;在基因表达水平上,温室白粉虱比B型烟粉虱更耐冷,而后者更耐热;Hsp70的Ton(或者Tmax)能代表这2种粉虱的温度耐受能力。本研究结果在一定程度上解释了自然界中这2种粉虱种群地理分布和季节发生差异的原因。     

瓜实蝇热激蛋白Hsp90基因克隆及表达分析

【目的】热激蛋白基因Hsps在生物体抗逆性过程中具有重要的作用,本文旨在通过阐释瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett)热激蛋白基因Hsp90在其对环境温度适应性及抗药性过程中的功能作用,为瓜实蝇综合治理提供理论基础。【方法】采用RACE-PCR技术克隆瓜实蝇的Hsp90基因cDNA序列,利用生物信息学工具分析序列特征,并通过实时定量PCR技术分析高温胁迫、阿维菌素诱导和抗性及敏感品系中该基因的表达情况。【结果】克隆获得的瓜实蝇Hsp90基因cDNA全长2 654 bp,命名为Bc-Hsp90,GenBank登录号为KP864677,含2 145 bp的开放阅读框,编码715个氨基酸蛋白,具有HSP90蛋白家族共有模式和1个基序标签,C-末端具有MEEVD基序,属于胞质型热激蛋白。系统发育分析显示,Bc-Hsp90基因高度保守。不同高温(32-40℃)胁迫处理1 h和2 h后,瓜实蝇成虫体内Bc-Hsp90的相对表达量均显著高于对照组(26℃),并在38℃和40℃表达量最高;阿维菌素长期筛选的RS品系,Bc-Hsp90表达量是对照SS品系的2.13倍,但RS品系以LC90剂量诱导后,Bc-Hsp_(90)表达量显著下调,随着恢复时间延长其表达量逐渐升高,96 h后恢复到对照水平。【结论】推测Bc-Hsp90在瓜实蝇耐热性和抗阿维菌素过程中可能起着重要作用。     

草地贪夜蛾热激蛋白基因SfHsp90的克隆及在高低温和UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本研究旨在探索草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda响应高低温和UV-A胁迫的分子机制。【方法】通过RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾热激蛋白基因Hsp90,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-qPCR技术检测草地贪夜蛾Hsp90基因在不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(去除触角和复眼的头、胸、腹、触角、复眼、足、翅、中肠、精巢和卵巢)及在不同时长(0, 30, 60, 90, 120和150 min)高温(36℃)、低温(4℃)和UV-A胁迫下成虫中的相对表达量。【结果】克隆获得草地贪夜蛾Hsp90基因,命名为SfHsp90(GenBank登录号:MN832694),该基因开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸,编码蛋白质相对分子量为82.52 kD,等电点(pI)为5.01,C末端序列含保守基序EEVD,说明该蛋白为胞质型热激蛋白。系统进化分析结果表明,昆虫Hsp90高度保守。发育表达模式显示SfHsp90在草地贪夜蛾1龄幼虫中表达量最高;组织表达模式显示,SfHsp90在草地贪夜蛾雌雄成虫的触角、复眼和去除触角和复眼的头中的表达量显著高于在其他组织中的。高低温胁迫对草地贪夜蛾SfHsp90表达具有明显的诱导作用,36℃胁迫下,SfHsp90表达量显著高于对照,且随着处理时间的延长,在雄成虫中表达量先上升后下降,在60 min时达到最高值,在雌成虫中表达量随处理时间延长逐渐升高;4℃胁迫下,在雄成虫中表达量随着处理时间的延长先上升后下降,在30 min时表达量达到峰值,在雌成虫中表达量随着处理时间延长逐渐上升;随着UV-A照射时间的延长,在雌雄成虫中表达量先上升后下降,90 min时在雄成虫中表达量达到最高值,60 min时在雌成虫中表达量达到最高值。【结论】草地贪夜蛾SfHsp90基因在高低温和UV-A胁迫下的差异表达说明该基因在草地贪夜蛾响应环境胁迫的分子机制中发挥重要作用。     

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

热应激和吡虫啉对大豆蚜hsp70和hsc70基因mRNA表达的影响

【目的】昆虫在高温或农药的胁迫下,通过高效表达热休克蛋白(HSP)等建立应激自我保护机制。本研究为从转录组水平上认识大豆蚜Aphis glycines在热应激和吡虫啉胁迫下hsp70和hsc70 mRNA表达分子机制,进而寻找自我保护应激反应中的薄弱环节,为大豆蚜的生物防治提供理论基础。【方法】采用同源克隆、RACE技术和实时荧光定量PCR等方法研究不同热激时间和热激后不同恢复时间及不同吡虫啉浓度对大豆蚜4龄若虫hsp70和hsc70的表达影响。【结果】37℃热激后,大豆蚜4龄若虫中hsp70表达量先上调,1 h时升至对照组的10.36倍（P<0.05）,然后逐渐下降。同样热激后恢复时间的长短对大豆蚜若蚜中hsp70的表达具有显著影响。热激处理后,大豆蚜若蚜中hsp70立即大量表达,表达量为对照组的8.78倍（P<0.05）,随后表达量下降至对照组水平,而hsc70的表达量并没有显著变化（P>0.05）。大豆蚜若蚜受吡虫啉的胁迫时,其hsp70和hsc70的表达量受吡虫啉的浓度及胁迫的时间的影响,呈现先升高后下降的趋势,具有明显的短期效应。【结论】吡虫啉诱导大豆蚜hsp70和hsc70表达量的上调;而热胁迫对hsp70和hsc70 mRNA具有不同的表达模式,高温可以诱导hsp70的表达,但对hsc70没有明显的诱导作用。     

低温对麦红吸浆虫滞育解除及蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90表达水平的影响

【目的】本研究旨在明确破茧率和破茧所需时间作为典型的专性幼虫期滞育昆虫麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育解除指标的可行性,探讨蜕皮激素受体基因EcR和热激蛋白基因Hsp70和Hsp90在低温解除滞育中的作用。【方法】9月上旬采自田间的麦红吸浆虫滞育幼虫在低温(4℃)和自然变温处理不同时间(0~90 d)后转移至24℃化蛹,调查幼虫的破茧率、化蛹率及破茧和化蛹所需时间;采用qPCR技术分析4℃低温终止滞育并在24℃下恢复发育的幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的mRNA水平。【结果】不同时间低温(4℃)和自然变温处理的麦红吸浆虫滞育幼虫破茧率和化蛹率以及破茧和化蛹所需时间均存在显著差异。未经低温(4℃)处理的幼虫在水分满足的条件下破茧率为71.3%,但均不能化蛹;低温(4℃)处理60 d内,随着处理时间的延长破茧率和化蛹率逐渐升高,破茧和化蛹所需时间逐渐缩短;与4℃低温处理30~60 d相比,自然变温处理30~60 d的幼虫化蛹率显著较低;4℃低温处理60 d和自然变温处理90 d后幼虫的化蛹率均超过91%。低温(4℃)处理显著提高了麦红吸浆虫幼虫EcR, Hsp70和Hsp90的表达量,其中处理30 d时其表达量最高,随着低温(4℃)处理时间的延长,表达量逐渐降低,大部分幼虫滞育解除后表达量趋于恒定。【结论】低温能显著促进麦红吸浆虫的滞育解除,效果优于9-10月自然变温;破茧率及破茧所需时间可作为评判麦红吸浆虫幼虫滞育强度的参考,但不能独立作为滞育解除的指标;EcR,Hsp70和Hsp90的表达水平与滞育强度密切相关,在麦红吸浆虫滞育解除中发挥潜在作用。     

热胁迫下棉花粉蚧内参基因的筛选

【目的】筛选出热胁迫下棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis的实时定量PCR最适内参基因。【方法】 本研究应用实时荧光定量PCR技术测定了棉花粉蚧2龄若虫、3龄若虫和雌成虫α-tub, β-tub, rpl32, GAPDH, SDHA和TBP共6个候选内参基因在7个不同温度处理（恒温18℃和 32℃, 以及37℃, 39℃, 41℃, 43℃和45℃热激处理1 h并在26℃恢复1 h）下mRNA表达水平的稳定性;应用geNorm, Bestkeeper, Normfinder和RefFinder软件分析6个基因表达的稳定性。【结果】 在不同高温胁迫下2龄若虫6个候选内参基因的稳定值M由小到大依次为α-tub（0.579）< GAPDH（0.654)< TBP（0.663）<β-tub（0.668）< rpl32（0.675）相似文献   

美国白蛾热激蛋白70基因的鉴定及功能分析

【目的】探究热激蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)基因在美国白蛾Hyphantria cunea抵御高温胁迫过程中的作用,为揭示美国白蛾的扩散机制以及预测潜在分布区提供理论支撑。【方法】利用PCR技术克隆美国白蛾HSP70基因,并进行生物信息学分析;利用qPCR技术检测新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在25, 30, 35和40℃处理下HSP70基因的表达特性;构建美国白蛾HSP70的原核表达载体,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞中诱导表达该蛋白,利用Ni²⁺-His柱纯化蛋白,并通过Western blot验证该蛋白;利用体外实验测定原核表达获得的重组蛋白在高温胁迫下的ATP酶活性。【结果】克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70(GenBank登录号: MT995848)和HcHSC70(GenBank登录号: MT261583),其ORF长度分别为1 917和2 061 bp,分别编码637和687个氨基酸,分子质量分别约为69.66和74.96 kD,等电点分别为5.90和5.96;氨基酸序列结构均含有3个高度保守的区域GIDLGTTYS, IFDLGGGTFDVSIL和VGGSTRIPKVQ,符合热激蛋白70家族的特征;蛋白三维结构均由N端ATPase功能域和C端底物结合功能域所组成。系统进化树显示HcHSP70与鳞翅目HSP70家族其他成员聚为一支,而HcHSC70与鳞翅目HSC70家族的其他成员聚为另一支。qPCR结果表明,新蜕皮的美国白蛾4龄第2天幼虫在热胁迫下HcHSP70的相对表达量显著上调,且在35℃处理2 h下达到峰值,而热胁迫下HcHSC70的表达响应较微弱。成功构建了HcHSP70的原核表达载体并在体外诱导表达。纯化后的重组蛋白HcHSP70具备ATPase活性,且在高温胁迫下酶活性稳定。【结论】本研究克隆获得美国白蛾2条HSP70基因HcHSP70和HcHSC70,明确了两条基因在高温处理下的表达特性;成功对美国白蛾HcHSP70进行原核表达及纯化,并证明重组蛋白HcHSP70在高温下具有稳定的ATPase活性,推测其在美国白蛾应对高温胁迫中发挥着重要作用。     

小分子热激蛋白基因HaHSP19.8在棉铃虫抗逆反应中的作用

【目的】小分子热激蛋白(small heat shock protein, sHSP)在昆虫抵御外界环境压力中至关重要。本研究旨在探究小分子热激蛋白sHSP19.8基因在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育、抵御高温胁迫和对Cry1Ac杀虫蛋白抗性机制中的作用,为更深入探析该基因作用机理及棉铃虫的防治奠定基础。【方法】通过PCR结合RACE克隆棉铃虫sHSP19.8基因序列,利用生物信息学软件对该基因序列进行分析;通过qRT-PCR测定Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫在40℃高温下处理1 h和2 h及饲喂含30 μg/mL Cry1Ac的人工饲料1 h和2 h后该基因的表达量,并测定抗感Cry1Ac棉铃虫不同发育阶段(1-5龄幼虫、蛹及成虫)和5龄幼虫不同组织(前肠、中肠、后肠、马氏管及表皮)中该基因的表达模式。【结果】获得了棉铃虫sHSP19.8基因的全长cDNA序列,命名为HaHSP19.8(GenBank登录号: XP_021195228.1),长608 bp,开放阅读框长528 bp,编码175个氨基酸残基,具有小分子热激蛋白的典型α-晶体结构域(α-crystallin domain, ACD)。该基因受40℃高温和30 μg/mL Cry1Ac杀虫蛋白诱导时在Cry1Ac敏感棉铃虫5龄幼虫中均过量表达;在Cry1Ac敏感棉铃虫整个发育阶段和5龄幼虫各组织中均表达,其中在成虫和5龄幼虫以及5龄幼虫表皮、马氏管和中肠内表达量较高;但是该基因在Cry1Ac抗性品系各个发育阶段和5龄幼虫各组织中表达量相比敏感品系都显著较低。【结论】结果说明HaHSP19.8参与棉铃虫生长发育和生理生化的过程,帮助昆虫抵御外界环境压力,并可能参与到棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制中。