对虾白斑综合症病毒结构蛋白VP28的原核表达和性质研究

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus ,WSSV)的一个重要的囊膜蛋白。为了便于研究VP2 8在和宿主细胞相互作用过程中扮演的角色 ,将VP2 8基因克隆到一个原核表达系统 ,对原核表达的VP2 8的特性进行了研究 ,并制备了抗VP2 8的多克隆抗体和单链抗体 ,对原核表达的和天然病毒的VP2 8蛋白免疫原性进行了比较。结果表示 ,原核表达的VP2 8与天然蛋白具有相似的免疫原性。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110 N端结构特征、原核表达及检测

VP110为对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的囊膜蛋白。相似性分析发现,VP110与昆虫DNA病毒经口感染关键因子PIF2具同源性,且同源区主要位于N端150~600aa。同时两者均在N端前端含一个跨膜区。为了研究VP110 N端保守区的功能,将vp110 N端基因(Svp110,450~1 830 bp)克隆至p ET-16b及p GEX-4T1原核表达载体中,同时分别在大肠埃希菌BL21(DE3)、Rosetta 2菌株中优化表达条件,诱导VP110 N端蛋白(s VP110)表达。实验结果表明,重组质粒p ET-16b-Svp110在37℃1 mmol/L IPTG条件下可得到表达,但16℃下表达量很低。而重组质粒p GEX-4T1-Svp110则在16℃下得到较高表达。同时,Rosetta 2菌株的表达量高于BL21(DE3)。该研究表明Rosetta 2菌株更适合作为WSSV结构蛋白的表达,同时VP110在不同载体中的表达受温度的影响。VP110 N端蛋白的表达为VP110的功能研究打下了基础。     

马麝出血症病毒VP60主要抗原表位区的串联表达及对家兔的免疫保护效力分析

马麝病毒性出血症(Moschus chrysogaster viral hemorrhagic disease,McVHD)为马麝的一种急性、高度致死性传染病,其病原马麝出血症病毒(Moschus chrysogaster hemorrhagic disease virus,McHDV)与兔出血症病毒高度同源。为了筛选McHDV保护性抗原,为McVHD疫苗研究奠定基础,文中通过对McHDV主要结构蛋白VP60抗原表位的分析,设计引物,应用RT-PCR技术扩增获得三段VP60主要抗原表位区核酸序列,并采用重叠延伸PCR将3段产物连接后克隆至原核表达载体pET-28a(+),成功构建原核表达质粒pET-truncated-VP60后转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。纯化表达产物免疫3–4月龄非RHD免疫兔,血凝抑制试验测定抗血清效价。首次免疫后21 d,通过攻毒保护试验分析重组蛋白的免疫保护效力。结果表明,McHDV VP60主要抗原表位蛋白在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子质量约为45 kDa,且以包涵体形式存在;重组蛋白纯化后配制疫苗免疫的新西兰白兔,可100%抵抗McHDV株的攻击,表明所筛选的抗原表位串联表达的重组蛋白具有良好的免疫保护效力,研究结果为McVHD新型疫苗的研发奠定了基础。     

诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备

目的获得纯化的诺如病毒(NV)衣壳蛋白VP1,免疫动物制备多克隆抗体。方法提取粪便样品中诺如病毒RNA,逆转录得到cDNA文库,通过PCR扩增获取VP1基因序列,构建到大肠埃希菌原核表达系统中诱导表达重组VP1蛋白。使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,以重组的VP1蛋白为抗原,免疫雄性SPF级SD大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价、Western blot检测抗体特异性。结果成功地构建出重组表达载体VP1-pET28a,并将其在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定地表达诱导重组蛋白。ELISA测其多抗血清的平均效价为1∶200 000,Western blot检测抗体在原核和真核特异性很高。结论本实验成功地利用原核表达系统表达诺如病毒衣壳蛋白VP1,为进一步研究诺如病毒的诊断和疫苗开发提供了条件。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP53B原核表达及抗血清的制备

【目的】研究对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)囊膜蛋白sVP53B克隆、表达、纯化及抗血清制备。【方法】根据WSSV囊膜蛋白基因序列,设计引物,PCR扩增出功能序列(Svp53B),构建到pET-16b载体后,转化至大肠杆菌Rosetta 2诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting检测优化表达。表达产物采用Ni-NTA琼脂糖磁珠进行纯化、割胶回收融合蛋白,以纯化的Svp53B-his为抗原,免疫兔子获得多克隆抗体,通过间接ELISA检测抗体的效价。【结果】构建重组质粒pET-16b-Svp53B,在大肠杆菌Rosetta 2中以1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,主要以包涵体形式表达。纯化包涵体蛋白免疫兔子,获得多克隆血清,效价达到1:150 000。【结论】原核表达并纯化得到高纯度的WSSV囊膜蛋白sVP53B,制备的兔源多克隆血清亲和力高、特异性好,这对后期进一步研究VP53B与经口侵染相关功能奠定了基础。     

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

鸡传染性法氏囊病病毒Gt株VP5基因缺失株感染性克隆的构建

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)是双链,双节段RNA病毒,其基因组由A、B两个节段组成,编码结构蛋白VP1-VP4和非结构蛋白VP5。【目的】利用反向遗传操作构建拯救VP5基因缺失重组IBDV。【方法】利用体外定点突变技术,缺失IBDV Gt株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGG的b肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtA △VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGmGtBHRT共转染DFⅠ细胞。【结果】RT-PCR和间接免疫荧光均显示获得重组病毒,将其命名为rmGtA △VP5。IBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为从分子水平上深入研究vp5基因功能奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备与应用

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是导致该病的主要病原, 研究将Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒GCRV-873株的外衣壳蛋白VP7基因进行原核表达, 获得高度纯化VP7重组蛋白, 通过免疫BALB/c小鼠, 首次制备筛选得到高效价单克隆抗体。结果显示, GCRV-I vp7基因可在原核表达系统中高效表达, 主要以包涵体形式存在, 大小约为40 kD。免疫小鼠后筛选到了5株IgG类型阳性杂交瘤细胞株, 其中3株亚型为IgG1, 2株亚型为IgG2a。Western Blot实验和直接免疫荧光实验显示, 该抗体可特异识别GCRV-873, 并且ELISA检测原核重组蛋白的效价高达204800, 亲和常数为4.04×109。研究制备的VP7蛋白单克隆抗体, 为GCRV-I病毒诊断技术开发及病毒感染机制的深入研究提供实验基础。     

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白VP2的密码子优化表达及其免疫原性研究

利用生物信息学软件对编码中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)VP2结构蛋白的密码子进行优化来提高VP2蛋白表达量,并进行免疫原性研究确定VP2蛋白的免疫原性。通过对17株囊状幼虫病毒(SBV)和7株中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的VP2基因序列进行比对,选取代表毒株(GenBank:HM237361.1)CSBV-LN株VP2基因作为参考序列,并用在CSBV所有毒株中保守性相对较强的氨基酸替换CSBV-LN株VP2对应位置的氨基酸,通过在线软件(http://www.jcat.de/和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)对其密码子进行优化,构建原核表达质粒pET-28a-optiVP2,并转化入BL21(DE3)中,进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westren blot鉴定正确后,将表达蛋白纯化并免疫至白来杭母鸡,对免疫鸡的抗体水平和淋巴细胞增值指数进行检测,研究CSBV VP2蛋白的免疫原性。同时,收集免疫后鸡蛋制备卵黄抗体,经纯化再与CSBV相互作用后,接种于3日龄蜜蜂幼虫,观察接种后幼虫死亡率,研究卵黄抗体中和CSBV病毒能力。结果显示,优化后的optiVP2能够在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有良好免疫原性,表达产物接种白来杭母鸡可诱导产生抗体,制备的卵黄抗体具有中和CSBV的作用。本实验实现了CSBV结构基因VP2在原核系统的高效表达,鸡免疫实验表明其具有良好免疫原性,并且可诱导鸡产生保护作用中和抗体,为进一步开发防治CSBV的生物制剂提供了帮助。     

一种抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)线性抗原表位单链抗体的筛选

对虾白斑综合症病毒(WSSV)是全世界对虾养殖业最主要的病原体之一, 虽然对该病毒的研究已较为深入, 但目前仍无有效的防治方法。本研究应用噬菌体展示技术, 构建了抗变性WSSV的单链抗体噬菌体展示文库, 分别以WSSV病毒粒子和原核表达的囊膜蛋白VP28为靶分子对该文库进行淘选。经过数轮淘选后, 得到5个能特异识别WSSV的单链抗体, 且首次获得了能特异识别WSSV线性抗原表位的单链抗体P75E8。并通过免疫胶体金电镜分析, 对5种单链抗体对应在病毒粒子上的表位进行了定位。为获取识别多种WSSV抗原的抗体提供了新的方法路线, 也为获取特异性识别线性表位的单链抗体提供了一种新的淘选技巧。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.