湖南烙铁头蛇毒蛋白组分的双向电泳分析

烙铁头蛇是世界上剧毒的蛇种之一,其所携带的毒素能够导致严重的机体损伤。应用蛋白质双向电泳技术,对湖南烙铁头蛇蛇毒蛋白的蛋白质组分进行分析。通过等电聚焦和SDS-PAGE凝胶电泳分析获得完整的烙铁头蛇毒全蛋白质的图谱,经胶体考马斯亮蓝染色后,应用PDQuest软件对蛋白表达谱进行分析。通过等电聚焦和SDS-PAGE凝胶电泳有83个蛋白质组分被检测出来。其中大约90.00%的蛋白质的相对分子质量(Mr)分布在15～45 kDa之间,大约72.29%的蛋白质等电点(pI)在4.0～7.0之间。通过对烙铁头蛇毒的蛋白组学研究,获得其蛇毒蛋白质组分的表征特点,为后续进一步研究各组分的身份和潜在功能奠定基础,既可以提出新的治疗方案又可以为新的药理应用提供宝贵资源。     

兔循环血中黄绿烙铁头蛇毒浓度与DIC出现关系研究

目的观察兔循环血中黄绿烙铁头蛇毒浓度与ＤＩＣ出现的关系。方法用抗烙铁头蛇毒的鼠多克隆抗体ＩｇＧ测定兔血中蛇毒浓度,以α２－ＰＩ、ＡＴ－Ⅲ活性和纤维蛋白原水平参数为ＤＩＣ指标。结果上述指标水平随血中蛇毒浓度的增加而降低,ＤＩＣ的发生与血中蛇毒浓度呈负相关系,高剂量的蛇毒可诱发ＤＩＣ。结论ＤＩＣ的发生取决于兔循环血中蛇毒的浓度。     

烙铁头(Trimeresurus mucrosquamatus)蛇毒的研究[Ⅰ]柱层析分离及酶活性与生物活性测定

本文报导了用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶A-50和氯化钠直线梯度洗脱方法,获得14个蛋白峰。测定了11种酶活性,含有精氨酸酯酶,蛋白水解酶,L-氨基酸氧化酶,5′-核苷酸酶,腺三磷酸酶,磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,核苷焦磷酸酶,磷脂酶A9种,不含核糖核酸酶,胆碱酯酶。对每个蛋白峰的生物活性测定表明,出血毒主要分布在12峰,其次为10—14峰。致死活性表现在1,12—14峰。1峰具有较强溶解纤维蛋白的活性。8,10—14峰具有明显的凝血酶样作用,酶活性的分布及其对凝血系统的作用接近一致。11—13峰能使血小板聚集。 烙铁头毒蛇在我国分布很广,成都生物所两栖爬行动物研究室1974年作过报导。蛇毒的研究已被许多学者所重视,Suzuki在Anthony.T.Tu.编著的Venoms Chemistry and Moleculor Biology(1977)报导了该蛇毒含磷酸单酯酶,磷酸二酯酶,5′-核苷酸酶及小分子活性多肽,1970年Ouyang报导含透明质酸酶,1963年Murata报导有蛋白水解酶活性。Ouyang等(1976—1978)分离纯化纤溶组分,并研究了该组分的理化性质。但对各组分的酶活性及生物活性测定尚未见报导。为充分利用这一丰富资源,我们对湖南产烙铁头蛇毒进行了柱层析分离和各组分的酶活性和生物活性测定,结果报导于下。     

尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的分离及其生物活性的研究

用二乙氨乙基纤维素柱层析法将尖吻蝮蛇毒分成15个组分,并对粗蛇毒及各分离组分进行了各种生物活力的测定,结果表明:1.粗蛇毒中存在有精氨酸酯酶,蛋白水解酶、碱性磷酸酶,磷酸二酯酶,5′—磷酸二酯酶,5′—核苷酸酶,ADP酶、ATP酶,L—氨基酸氧化酶及磷酸酯酶A等10种酶活力;但不存在胆碱酯酶及核糖核酸酶的活力;2.蛋白水解酶,5′—核苷酸酶及ADP酶普遍存在于粗蛇毒经分离后的各组分中;3.精氨酸酯酶存在于组分6—13中,以第8组分的活性最高;4.第1及5—13组分显示有较高的凝血活性,第1—2组分及9—15组分显示有出血毒,第12(小鼠死亡率2/5)及第13组分(小鼠死亡率3/5)显示有较高的毒性;第1—2,9—15组分显示有纤溶活性。     

尖吻蝮(Deinagkistron acutus)生长过程不同时期排毒量及蛇毒组分的变化

对人工培育的4个年龄段尖吻蝮蛇毒和野生成体尖吻蝮蛇毒进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.结果显示3龄以前尖吻蝮蛇毒蛋白电泳图谱,无论是在分带、泳动率及相应组分的量等方面,均呈现一定的差异,但随着尖吻蝮蛇龄的增长,蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇蛇毒蛋白电泳图谱越来越接近.3龄尖吻蝮生长发育达到性成熟,其蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇趋于一致.蛇毒组分的变化,提示了尖吻蝮的生长发育进程.     

竹叶青蛇毒凝血酶样酶氨基酸序列报道

蛇毒凝血酶样酶可作为蛋白酶结构与功能研究的良好模型,并已广泛用于各种血栓疾病的诊断和治疗,因而测定其一级结构具有重要意义．利用逆转录与聚合酶链反应相结合的ＲＴ－ＰＣＲ法,扩增出竹叶青蛇毒凝血酶样酶（ＴＳＶ－ＴＥＬ１）的ｃＤＮＡ;将扩增的ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,经末端终止法测定核苷酸序列,推导出竹叶青蛇毒凝血酶样酶的全序列．竹叶青蛇毒凝血酶样酶由２３４个氨基酸组成并含有１个位于Ａｓｎ２０的Ｎ－型糖基结合位点．竹叶青蛇毒凝血酶样酶序列与其它蛇种来源凝血酶样酶具有较大相似性,其与黄绿烙铁头蛇毒凝血酶样酶序列相似度为８４％,与美洲矛头蝮蛇毒凝血酶样酶序列相似度为６８％,而与牛凝血酶Ｂ链序列相似度仅为２５％．     

普通离子交换剂用于HPLC柱层析法快速分离眼镜王蛇毒

目的　为了经济快速分离眼镜王蛇(Ophiophagushannah,Oh)蛇毒中的毒素成分。　方法　用普通离子交换剂于高效液相色谱柱 (HPLC) TSKgel SP-Toyopearl 65 0 SF (4× 1 5 0 mm)层析法 ,实验取得最佳分离条件后 ,将蛇毒样品上柱后进行梯度洗脱 ,各洗脱峰收集后在 Cosmosil 5 C4-AR-3 0 0柱 (4 .6× 1 5 0 mm)上进行逆相 HPLC分析。非单峰组分再进行 HPLC凝胶过滤柱TSKgel Toyopearl HW-40 Fine(4× 2 5 0 mm)层析 ,层析峰组分再进行 HPLC逆相分析。　结果　眼镜王蛇毒经HPLC离子交换柱层析获得了 1 6个蛋白组分 ,其中有 5个组分经逆相 HPLC分析单一组分 ;另外的复合性组分再进行 HPLC凝胶过滤柱层析后又得到 5个单峰蛋白组分。　结论　HPLC离子交换柱层析对分离蛇毒蛋白很有实用价值 ,特别是蛇毒样品量少的情况下 (1 0 ug)也能较好分离。还具有分离时间短 (1 h左右 ) ,无须低温条件等优点。HPLC凝胶过滤柱层析可进一步使蛋白组分得到提纯     

菜花烙铁头蛇毒金属蛋白酶Jerdonitin的分离纯化和理化性质

以前从菜花烙铁头蛇毒中分离纯化到Jerdonitin。与其他Ⅱ型蛇毒金属蛋白酶相比,Jerdonitin由金属蛋白酶和去整合素两个结构域组成。但没有检测到其出血和纤维蛋白原降解活性,推测可能高压液相色谱的有机溶液影响了其酶活性。采用不含高压液相色谱柱层析的新分离手段分离得到Jerdonitin。Jerdonitin在还原和非还原SDS—PAGE电泳中分别呈现一条表观分子量为38和36kDa的条带。像其他典型的蛇毒金属蛋白酶一样,Jerdonitin优先降解人纤维蛋白原的alpha链,并且该活性能被EDTA完全抑制,而PMSF对其没有影响。Jerdonitin不诱导小白鼠皮下出血。     

四个烙铁头蛇毒凝集素样蛋白基因的克隆与序列分析

从烙铁头蛇（Trimeresurus mucrosquamatus)的毒腺中提取mRNA,利用RT－PCR进行体外扩增,获得凝集素样蛋白基因,克隆至PMD18－T载体中,筛选出4种凝集素样蛋白基因（命名为TML-1、MTL－2、TML－3和TML－4）。由基因序列推导出的氨基酸序列表明：TML－1,2,3,4序列中均有CRD结构。序列同源性比较和Cys位点分析推测：TML－1和TML－2可能分别是类似于flavocetin-A的蛇毒凝集素样蛋白的α亚基和β亚基;TML－3可能类似于GPIb-bp的蛇毒凝集素样蛋白的α亚基,TML－4则可能是类似于Ⅸ/Ⅹ-bp的蛇毒凝集素样蛋白的β亚基。     

蛇毒凝血酶原激活组分的研究概况

<正>蛇毒是一类复杂的具有多种生物学活性的蛋白质和蛋白多肽。目前已经分离纯化出许多作用于血液凝固酶促级联反应过程中的一个或多个环节的蛇毒组分,包括FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅩ等激活剂以及直接使纤维蛋白原凝聚的蛇毒凝血酶样酶。蛇毒蛋白中有一类凝血毒素作用于血液凝固酶促级联反应,发挥止血作用,作用方式:(1)激活内源性和外源性凝血途径中的各种凝血因子,从而促进血液凝固。(2)激活凝血酶原,从而发挥凝血作用。(3)直接使纤维蛋白原变成纤维蛋白,即类似凝血酶样作用[1]。现已在临床上广泛     

蛇毒素蛋白毕赤酵母表达进展

蛇毒是许多具有独特生物活性的蛋白质与酶的混合物,在基础科学研究和临床上有重大应用价值,但是通过从蛇毒中分离获取活性组分具有局限性。巴斯德毕赤酵母表达系统是最为常用的真核表达系统之一,其真核加工、折叠、翻译后修饰等能力使得所表达的重组蛋白具有与天然蛋白近似的生物活性,因而该系统在富含二硫键或糖基化的蛇毒素蛋白表达中被广为采用。迄今为止,已经有12个属的25种蛇毒素蛋白(包括蛇毒丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶/去整合素、L-氨基酸氧化 酶、C-型凝集素和神经毒素、血管收缩因子、神经生长因子等家族)在毕赤酵母中获得成功表达,蛇毒富半胱氨酸蛋白、缓激肽增强肽(BPP)等至今尚未见酵母表达的报道。毕赤酵母表达蛇毒素蛋白失败的原因可能在于,有关密码子偏爱性、目的基因转录出的RNA二级结构特征、糖基化程度不均一及糖型差异、所表达毒素对酵母细胞的毒性等方面,并对解决的方法进行了讨论。     

蛇毒与细胞因子研究进展

全世界共有蛇类2500余种,其中毒蛇约650余种,估计每年被毒蛇咬伤的人数在30万以上,死亡率约为10％。我国蛇类有160余种,其中毒蛇约有50余种。剧毒、危害剧大的有10种,如眼镜蛇王、金环蛇、眼镜蛇、五步蛇、银环蛇、蝰蛇、蝮蛇、竹叶青、烙铁头、海蛇等,咬伤后能致人于死亡。我国两广地区蛇害严重,每年蛇咬伤的发病率约为25/10000。蛇毒的成分比较复杂．主要由蛋白质、多肽类和多种酶类组成。蛇毒对机体的作用比较复杂,按其有毒成分的毒理作用可分为神经毒、血循环毒和混合毒三类。银环蛇、金环蛇、海蛇的蛇毒主要含神经毒,其主要作用特点为通过多种不同的方式阻断神经一肌肉接头的冲动传递而导致呼吸肌麻痹,是蛇伤致死的主要原因;蝰蛇、五步蛇、烙铁头和竹叶青的蛇毒主要含血循环毒,包括心脏毒、凝血毒、溶血毒、蛋白水解酶、透明质酸酶等;眼镜王蛇等蛇毒属于混合毒,此类蛇毒既含神经毒成分,又含血循环毒成分。     

尖吻蝮（Deinagkistrodon acutus）生长过程不同时期排毒量及蛇毒组分的变化

对人工培育的4个年龄段尖吻蝮蛇毒和野生成体尖吻蝮蛇毒进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果显示：3龄以前尖吻蝮蛇毒蛋白电泳图谱,无论是在分带、泳动率及相应组分的量等方面,均呈现一定的差异,但随着尖吻蝮蛇龄的增长,蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇蛇毒蛋白电泳图谱越来越接近。3龄尖吻蝮生长发育达到性成熟,其蛇毒蛋白电泳图谱与野生成蛇趋于一致。蛇毒组分的变化,提示了尖吻蝮的生长发育进程。     

烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶研究 Ⅰ分离纯化及理化性质(英文)

通过DEAE-SephadexA-50,DEAE-SepharoseCL-6B,MonoQ （FPLC）三步离子交换柱层析,纯化得到一新的纤维蛋白原溶酶,在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单一的蛋白带。分子量为2600,等电点pl4.7;它是一个糖蛋白,含糖量6.4%,其中中性糖0.3%,已糖胺4.9%,唾液酸1.2%。烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg由187个氨基酸组成,含有较高的酸性氨基酸,此外甘氨酸含量也较高。TMVFg热稳定性强,而酸不稳定,在280 nm处具有典型的蛋白吸收峰,在无离子水中紫外消光系数E0.1%/280 nm=1.558。纯化的TMVFg具有较强的精氨酸酯酶活力,对苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）的Km值为1.4×10[-3]M。TMVFg的活性受苯甲基丹磺酰氟（PMSF）抑制;乙二胺四乙酸（EDTA）对活性无影响。TMVFg不能使纤维蛋白原凝固,但能水解纤维蛋白原α、β链。纤溶实验表明TMVFg具有激活纤溶作用。纯化的烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶对酪蛋白无作用,无出血活性,因而与凝血酶样酶、出血毒素及β-纤维蛋白原溶酶（OUYANG et al.,1977）明显不同。     

烙铁头蛇毒素纤维蛋白原溶酶研究:Ⅱ.对纤维蛋白原及凝血酶的作用

烙铁头（T.mucrosquamatus）蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg能水解三肽底物Bz-Phe-Val-Arg-PNA，但对凝血酶的良好底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA却活性甚低。TMVFg显著延长血浆凝血酶时间、血浆复钙时间及纤维蛋白原溶液凝血酶时间。同时，TMVFg体外也能延长全血凝固时间，表明具有抗凝作用。纤维蛋白原-纤维蛋白转换实验表明：TMVFg水解纤维蛋白原产生的纤维蛋白原断片（FDP）除具有抗凝血酶，抑制纤维蛋白聚合活性外，还能促进纤维蛋白的聚合。进一步用FPLC分离TMVFg水解人纤维蛋白原混合液，得两个FDP断片功能峰，FDP组分Ⅰ和FDP组分Ⅱ。其中FDP组分Ⅰ能抑制纤维蛋白凝块形成；FDP组分Ⅱ能促进纤维蛋白凝块形成，抑制TMVA（烙铁头蛇毒血小板活化素，它可不通过ADP、花生四烯酸途径而诱导血小板聚集），但对ADP诱导的家兔血小板聚集无影响。TMVFg对凝血酶水解三肽底物Cbz-Gly-Pro-Arg-PNA及凝固纤维蛋白原的活性也有一定抑制作用。实验证明，TMVFg抗凝的主要作用机理是其水解纤维蛋白原产生的断片对纤维蛋白原凝固的抑制作用、FDP断片抗凝血酶作用及TMVFg本身对凝血酶活性的抑制所引起的，但在二者之间，前者是主要的。从研究结果发现：TMVFg水解纤维蛋白原所产生的断片有一类能加速凝血酶凝固纤维蛋白原的过程，这就发现了FDP断片的新功能。它证明了FDP断片作为血液凝固、纤溶正反馈调节因子的功能。这一类FDP断片还能抑制TMVA诱导的血小板聚集，因此，烙铁头蛇毒纤维蛋白原溶酶TMVFg将成为研究血液凝固调节系统及血小板聚集第三条途径的强有力试剂。     

泽井的故事

昭和三十八年(1963年)——.研究烙铁头咬伤已经进入第四个年头了.这些年来,泽井多次访问了奄美大岛、德之岛和冲绳岛,从保健所和当地的医生那儿把握了蛇伤的发展情况,直接走访了患者并进行了预后跟踪调查,回到东京的研究室对调查的结果进行分析,反复考虑什么是“最好的对策”,可以说一刻也没有忘记烙铁头的事.从昭和三十二年(1957年)第一次访问奄美大岛后,泽井就开始进行蛇伤患者的预后调查.调查的目的是为了摸清在什么程度上减少了死亡率和坏死的发生.随着冻干抗毒血清的开发,EDTA 等急救用药品的普及,那些离得很远的小岛和偏僻地区的死亡率在这四年里已经逐渐减少.也就是说死     

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)毒的抑菌作用及其抑菌组分L-氨基酸氧化酶的分离纯化

我们用平皿测活法研究了江浙蝮蛇毒对真菌和大肠杆菌生长的抑制作用，并对其抗细菌的组分进行柱层析分离纯化，得到组分单一的LAO不仅有抑菌作用还有L-氨基酸氧化酶的活性。纯化后LAO的比活力为808U／mg。蛇毒经酸性聚丙烯酰胺电泳后测抑菌活性发现有3个抑菌组分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，LAO为抑菌组分Ⅱ。     

蛇毒神经毒素影响神经信号传递过程的研究进展

早在二十世纪初,人们就开始应用蛇毒来缓解恶性肿瘤疼痛、神经痛和关节痛,随后出现一系列关于蛇毒有类似吗啡样镇痛作用的报道。蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物。蛇毒的千物质中90％以上是蛋白质．是其毒性和其它生物学活性的主要成分。根据蛇毒的不同组分及产生的不同的生物学效应,可将蛇毒分为几类,其中神经毒索有镇痛、影响神经肌肉接头等作用,主要是通过多种不同的方式改变中枢和周围神经系统正常的兴奋传递,从而影响正常的神经活动。在此,     

两个菜花烙铁头蛇毒金属蛋白酶去整合素基因的克隆与序列分析(英文)

从菜花烙铁头蛇的毒腺中 ,利用RT PCR进行体外扩增 ,克隆到 2个金属蛋白酶 去整合素基因 ,命名为TJM 1、TJM 2 .TJM 1cDNA全长为 15 2 8bp ,编码 4 81个氨基酸 ;TJM 2cDNA全长为 15 78bp ,编码 4 84个氨基酸 .TJM 1和TJM 2都属于Ⅱ型蛇毒金属蛋白酶 ,由信号肽、前肽、金属蛋白酶、间隔肽和去整合素 5部分组成 .Ⅱ型蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列的比较及进化分析显示 ,它可进一步分为两类 ,一类包括大多数Ⅱ型蛇毒金属蛋白酶 (其中含有TJM 1) ,而TJM 2和agkistin则组成了另一类 .并且TJM 2和agkistin的第 4 0 7位和第 4 2 6位残基都是半胱氨酸 ,而在其它Ⅱ型金属蛋白酶的相应位置 ,4 0 7位是丝氨酸 ,4 2 6位则缺失 .TJM 2和agkistin均有可与整合素α2 Ⅰ区域特异性结合的片段Q NRKRHDNAQ(残基 2 76～ 2 84 ) ,这个片段在其它Ⅱ型金属蛋白酶中并没有发现 .因此推断 ,TJM 2和agkistin可能属于一类新型的Ⅱ型蛇毒金属蛋白酶 .     

日本毒蛇

生存在日本的毒蛇,以广泛地分布在北自北海道,南至九州元蝮蛇和分布在奄美群岛以南之烙铁头为代表。烙铁头又有花稍烙铁头和小烙铁头。过去一直被认为属于无毒之赤练蛇,现被证明是有毒的,已有人报道被赤练蛇咬伤致死或严重中毒的事例。就全国来说,虽然难以精确掌握毒蛇咬伤例数,但只就蝮蛇咬伤而言,每年大约可达三千人。近年来随着农村的都市化和住宅周围环境的修整,使蛇咬伤人数明显减少,但仍有些地方没有多大变化。以冲绳县之烙铁头咬伤为例,1964～1971年,每年平均咬伤为353名,死亡4名(1.1％),1977年为292名,死亡2名(0.7％),1985年为184名,无死亡病例。无论从咬伤例数或死亡例数看,都在减少,令人可喜。但一旦被咬,并非都是轻症。最近仍有被蝮蛇咬伤而致死或其它重伤病例。其中也