马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利用RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHR-I基因(potato Phytophthora infestans-induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA。序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinI有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83％和81％)。Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2、3个拷贝。对其诱导表达模式研究表明：晚疫病病原菌接种36h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCI浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达。该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关。     

马铃薯糖转运蛋白基因的克隆及表达分析

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白,在植物的生理活动和生长发育过程中发挥着重要功能。为了解马铃薯SWEET基因的相关信息,探究其在马铃薯不同组织以及在生物胁迫与非生物胁迫下的表达特性。该研究采用同源克隆技术从马铃薯‘青薯9号’中克隆了StSWEET5基因(GenBank登录号为MN295671),其CDS序列长度为717 bp,编码238个氨基酸。系统进化树分析结果表明,StSWEET5与番茄的氨基酸序列相似性最高(97.06%)。qRT-PCR分析表明:StSWEET5基因在马铃薯各组织(根、茎、叶、花、块茎、匍匐茎)中均有表达,且在花中的表达显著高于其他组织;糖胁迫下,StSWEET5基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达差异最为显著(P0.05)。在晚疫病菌(Phytophthora infestans)诱导后36 h时,表达量达到最高,随后急剧下调。推测StSWEET5基因参与了马铃薯糖胁迫以及响应了晚疫病诱导的过程。     

利用抑制差减杂交技术分离马铃薯晚疫病抗性相关基因

以晚疫病病原菌混合小种接种处理48h的马铃薯水平抗性材料(R-gene-free)叶片为目的材料,以未处理材料作为对照,用抑制差减杂交技术构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的差减文库。应用反向Northern技术对840个克隆进行斑点杂交筛选,筛选出150个病原诱导后信号明显增强的克隆。26个片段测序结果表明：部分片段基因功能与抗病性明显相关。7个差异表达片段与GenBank EST数据库中已有晚疫病原诱导马铃薯叶片得到的EST有很高同源性(达95％～100％);部分片段核苷酸或氨基酸序列分别与番茄、烟草、拟南芥等的EST序列或氨基酸序列有较高同源性;另有4个基因片段在GenBank EST数据库中未找到明显的同源序列,可能为新发现的基因片段。     

cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA

为克隆马铃薯晚疫病抗性相关基因,深入研究马铃薯晚疫病抗性机制,应用SMART LD—PCR技术,以晚疫病菌混合小种诱导48h的水平抗性马铃薯(Solanum tuberosum L．)(R—gene—free)叶片为材料,构建了一个富集晚疫病抗性相关基因的cDNA文库。为提高克隆全长cDNA的效率,将cDNA文库与RACE技术结合,依据本实验室得到的病原诱导表达片段测序结果,在其内部设计两个特异引物,与文库载体臂上的通用引物配对,以文库噬菌体DNA为模板,用高保真PCR分别扩增出cDNA5′端与3′端,从而简便、快捷地得到全长cDNA序列。采用此方法,在马铃薯中克隆了一个受晚疫病菌诱导表达的cDNA,该cDNA长904bp,5′端有29bp的非翻译区,3′端具有完整的polyA尾,包含一个678bp的完整开放阅读框架,编码226个氨基酸(GenBank登录号：AY 185207)。BLAST检索发现其氨基酸序列与烟草一个新的病程相关蛋白基因NtPRp27具有90％的同源性,在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。Northern杂交结果表明,水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、机械伤害和渗透胁迫都能诱导该基因表达。该基因可能是马铃薯一个新的病程相关蛋白基因。     

马铃薯泛素结合酶基因StUBC17的克隆与功能分析

泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating Enzyme E2,UBC)与植物生长发育和抗病反应密切相关。为了解泛素结合酶基因对植物抗晚疫病的贡献,从马铃薯栽培种"合作88"中克隆出一个E2泛素结合酶基因,命名为StUBC17,并对其受晚疫病菌诱导表达特性及功能进行分析。利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术降低本氏烟(Nicotiana benthamiana)中StUBC17同源基因(NbUBC)的转录水平,再接种晚疫病菌进行抗病性鉴定。进一步在基因沉默植株上瞬时表达马铃薯抗病基因和其相应的无毒基因(R3a+AVR3a、R3b+AVR3b和Rx+CP)及INF1。StUBC17编码区全长447 bp,编码148个氨基酸,其蛋白分子量为16.52 kD,理论等电点为7.72。表达分析结果表明,StUBC17受晚疫病菌诱导表达。抗病鉴定结果显示,与对照植株相比,NbUBC沉默植株的抗病性显著降低。沉默NbUBC不影响过敏反应(Hypersensitive responses,HR)的发生。StUBC17是植物防御晚疫病所需,但该基因的沉默并不影响R3a、R3b、Rx及INF1介导的HR反应。     

不结球白菜BcTuR1基因的克隆及表达

从不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)品种‘短白梗'中克隆到一个抗TuMV相关基因,命名为BcTuR1(GenBank登录号FJ600374).该基因核苷酸序列全长1 019 bp,编码162个氨基酸.BcTuR1基因与芥菜抗病毒基因相似性最高为96%,其它没有与该基因相似性高于50%的序列.基因组DNA杂交表明,BcTuR1可能属于一个较小的多基因家族.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuR1基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

不结球白菜BcTuRsO基因的克隆及表达

从不结球白菜抗病品种短白梗中克隆到一个抗芜菁花叶病毒(TuMV)相关基因,命名为BcTuRsO(Gen-Bank登录号FJ600376).该基因核苷酸序列全长650 bp,编码194个氨基酸,与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性.系统进化树分析表明,该基因在不同物种之间具有保守性.基因组DNA杂交表明,BcTuRsO基因可能以单拷贝形式存在,其表达是组成型的.实时定量PCR检测表明,芜菁花叶病毒能够诱导不结球白菜BcTuRsO基因的转录表达,其在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病毒的抗性.     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.     

马铃薯晚疫病菌全基因组分泌蛋白的初步分析

利用马铃薯晚疫病菌全基因组测序结果,结合计算机技术和生物信息学的方法,对马铃薯晚疫病菌的蛋白进行分析,为明确该病原菌与寄主互作的分子机制奠定基础。文章应用信号肽预测软件SignalP v3.0和PSORT,跨膜螺旋结构预测软件TMHMM-2.0和THUMBUP,GPI锚定位点预测软件big-PI Predictor,亚细胞器中蛋白定位分布预测软件TargetP v1.01,对已经公布的马铃薯晚疫病菌全基因组22 658个蛋白质氨基酸序列进行分析。结果发现,晚疫病菌全基因组编码蛋白中有671个为潜在的分泌型蛋白,占编码蛋白总数的3.0%。其中有45个分泌蛋白有功能方面的描述,其功能涉及细胞代谢、信号转导等方面;此外,还有一些与激发子类似的分泌蛋白,它们可能与晚疫病菌的毒性有关。     

巴西橡胶树液泡ATP酶F亚基基因克隆及表达

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术分离了一个巴西橡胶树ATP酶 F亚基基因,命名为HbVHA-F.结果显示,该基因cDNA全长658 bp,含有完整的阅读框架,编码130个氨基酸.序列比对及结构预测分析表明,HbVHA-F编码的氨基酸序列与杨树、水稻、黄麻、小麦和香蕉中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到88.46%、86.15%、84.62%、83.85%和74.62%,与杨树一致性最高,并与其他高等植物聚为一类.半定量RT-PCR分析显示,割胶(机械伤害)和乙烯利能够诱导HbVHA-F基因的表达.HbVHA-F基因可能通过转录表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控.     

An elicitor-and pathogen-induced cdna from potato encodes a stress-responsive cyclophilin

Differential mRNA display was used to identify pathogen-responsive, stress-related genes in potato cell suspensions treated with salicylic acid and a cell wall-derived elicitor from Phytophthora infestans. Among the positive clones identified, one was found to be expressed at a significantly higher level in elicited cells than in control cells. DNA sequencing of this amplicon revealed high homology and identified it as a potato cyclophilin cDNA. The maximum amount of the cyclophilin mRNA was found 9 to 12 h after elicitation. Cyclophilin (CyP) mRNA synthesis was also up-regulated from 12 to 24 h in potato leaves locally infected with zoospores from Phytophthora infestans. However, untreated leaves responding systemically to the pathogen showed only a weak, delayed response at 24 h post infection. The observed accumulation of potato CyP mRNA in response to salicylic acid, P. infestans elicitor and P. infestans infection, suggest that CyPs play an important role in plant stress responses.     

马铃薯非共生血红蛋白基因StHb1的克隆及表达

采用RT-PCR技术成功分离了马铃薯StHb1基因序列.经半定量RT-PCR分析表明,StHb1基因的表达在抗性品种(陇薯三号)和感性品种(荷兰十五)块茎中均受致病疫霉的侵染所抑制;StHb1基因在正常生长的马铃薯块茎组织中表达量最高;外源NO和H2O2的作用可明显地抑制StHb1基因的表达,但在抗性品种中该基因受抑制的程度低于感性品种.上述试验结果暗示了StHb1基因与马铃薯对致病疫霉侵染的抗性应答具有一定的相关性.     

马铃薯StNPR4基因的克隆与功能分析

为探究StNPR4基因在马铃薯（Solanum tuberosum）中应对生物胁迫和非生物胁迫的功能,本研究通过克隆StNPR4的CDS序列和启动子序列,进行生物信息学分析;利用qRT-PCR进行组织表达特异性分析;同时构建了由其自身启动子驱动的StNPR4双元表达载体,转化马铃薯获得了转基因马铃薯,研究转基因马铃薯对水杨酸、致病疫霉和高盐胁迫的响应。结果显示：StNPR4具有典型的NPR1家族的功能结构域,启动子上具有响应于生物胁迫和非生物胁迫的顺式作用元件。StNPR4在叶中的表达量最高;StNPR4受SA诱导表达,且在转基因植株中的诱导表达程度高于对照;转基因马铃薯增强了对致病疫霉的抗性,在高盐胁迫下生根率更高。说明StNPR4不仅在马铃薯生物胁迫中发挥重要作用,而且在非生物胁迫中也扮演着重要角色。