蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶在构象上的差别以及亚基的相互作用

(1)用硫酸铵分级,然后磷酸纤维素亲和层析得到了均一的蛇肌醛缩酶,凝胶过滤法测定全酶分子量为160,000,SDS-凝胶电泳法测定了它的亚基分子量为40,000,表明蛇肌醛缩酶是一个四亚基的酶,它属于醛缩酶I-A型。(2)甲醇或尿素对蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶的影响是不同的。当用胰蛋白酶分别消化蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶时,发现蛇肌醛缩酶对胰蛋白酶的作用更为敏感。甲醇或尿素对酶活性影响的结果说明蛇肌醛缩酶有更紧密的构象,酶分子内部的疏水键在维持活化型时起着重要的作用,在低有机溶剂浓度时不受影响,而在高有机溶剂浓度时分子内部疏水键才遭到破坏。此外蛇肌醛缩酶分子表面的极性基团,包括赖氨酸和精氨酸形成的离子对可能更易受到胰蛋白酶作用,同时它们可阻止低浓度甲醇与酶分子内疏水键作用。(3)醛缩酶和TNBS之间的反应支持酶分子的氨基,尤其是蛇肌醛缩酶的氨基在维护其天然构象中起着特殊作用的观点。(4)虽然蛇肌醛缩酶和兔肌醛缩酶的构象有一定的不同,但是仍然能够进行杂交产生蛇肌-兔肌醛缩酶杂交株组,说明它们亚基之间的结合区域的差别并不很大。     

蛇肌醛缩酶中巯基的研究

用DTNB为修饰试剂,较为详细地研究了蛇肌醛缩酶各类巯基的反应性能与作用。蛇肌醛缩酶由四个亚基组成,在尿素存在下,酶分子总的巯基数为32;而天然醛缩酶中仅测定到16个巯基,同时酶活性丧失。此外观察到天然醛缩酶中有4个对DTNB呈快速反应的巯基,它们的被修饰并不影响活性。底物存在情况下,天然蛇肌醛缩酶中,仅测到10个巯基,而酶活性基本上不受影响,这表明有6个巯基被底物所保护,这6个巯基可能就是表现酶催化活性所必需的巯基。在底物存在情况下,用NEMI修饰蛇肌醛缩酶,然后加入巯基乙醇停止反应,过量的试剂借透析除去,此时修饰了的酶制剂仍保留着绝大部分活性。再用DTNB去检测巯基,可测定到6个,同时活性也丧失了。当可逆地除去DTNB时,酶活性又重新逐渐恢复。此实验进一步支持蛇肌醛缩酶中有6个巯基是表现活性所必需的。我们过去工作指出蛇肌醛缩酶构型稍不同于兔肌醛缩酶,目前结果表明蛇肌醛缩酶的四个亚基的对称性可能不是完全相同的。     

蛇肌醛缩酶中巯基的研究

用DTNB为修饰试剂,较为详细地研究了蛇肌醛缩酶各类巯基的反应性能与作用。蛇肌醛缩酶由四个亚基组成,在尿素存在下,酶分子总的巯基数为32;而天然醛缩酶中仅测定到16个巯基,同时酶活性丧失。此外观察到天然醛缩酶中有4个对DTNB 呈快速反应的巯基,它们的被修饰并不影响活性。底物存在情况下,天然蛇肌醛缩酶中,仅测到10个巯基,而酶活性基本上不受影响,这表明有6个巯基被底物所保护,这6个巯基可能就是表现酶催化活性所必需的巯基。在底物存在情况下,用NEMI 修饰蛇肌醛缩酶,然后加入巯基乙醇停止反应,过量的试剂借透析除去,此时修饰了的酶制剂仍保留着绝大部分活性。再用DTNB 去检测巯基,可测定到6个,同时活性也丧失了。当可逆地除去DTNB 时,酶活性又重新逐渐恢复。此实验进一步支持蛇肌醛缩酶中有6个巯基是表现活性所必需的。我们过去工作指出蛇肌醛缩酶构型稍不同于兔肌醛缩酶,目前结果表明蛇肌醛缩酶的四个亚基的对称性可能不是完全相同的。     

兔肌醛缩酶中色氨酸残基的分布及其作用

在不同条件下,用NBS修饰兔肌醛缩酶的色氮酸残基。pH4.0时测定到全酶分子的总色氨酸残基数为12,用邹氏图解法求得其中2个色氨酸残基为表现活性所必需。而在pH7.5条件下,仅鉴定出2个色氨酸残基。这些实验表明此2个色氨酸残基很可能就位于分子表面。此外,紫外光谱和萤光光谱指出,pH4.0时,NBS 引起酶构型的较大的变化,而在pH7.5时仅引起较轻微变化。这些结果认为:醛缩酶的四个亚基对整个分子构象的贡献是不完全相同的,同时醛缩酶整个分子也是不对称的。     

文昌鱼和草鱼醛缩酶的巯基

前文报道了巯基是兔肌和蛇肌醛缩酶表现活力所必需的残基,他们的巯基总数为32个,但是用两种巯基试剂对上述两种醛缩酶进行分步修饰表明兔肌醛缩酶的必需巯基为8个,而蛇肌醛缩酶的必需巯基为6个。Brenner-Holzach报道果蝇醛缩酶的巯基全部包埋在分子内部,与活力无关。由于醛缩酶是广泛存在的,Rutter把醛     

文昌鱼和草鱼醛缩酶的巯基

前文报道了巯基是兔肌和蛇肌醛缩酶表现活力所必需的残基,他们的巯基总数为32个,但是用两种巯基试剂对上述两种醛缩酶进行分步修饰表明兔肌醛缩酶的必需巯基为8个,而蛇肌醛缩酶的必需巯基为6个。Brenner-Holzaoh报道果蝇醛缩酶的巯基全部包埋在分子内部,与活力无关。由于醛缩酶是广泛存在的,Rutter把醛     

兔肌醛缩酶中色氨酸残基的分布及其作用

在不同条件下,用NBS修饰兔肌醛缩酶的色氨酸残基。pH4.0时测定到全酶分子的总色氨酸残基数为12,用邹氏图解法求得其中2个色氨酸残基为表现活性所必需。而在pH7.5条件下,仅鉴定出2个色氨酸残基。这些实验表明此2个色氨酸残基很可能就位于分子表面。此外,紫外光谱和萤光光谱指出,pH4.0时,NBS引起酶构型的较大的变化,而在pH7.5时仅引起较轻微变化。这些结果认为:醛缩酶的四个亚基对整个分子构象的贡献是不完全相同的,同时醛缩酶整个分子也是不对称的。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH 在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH 从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill 系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过景底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5'-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过量底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5′-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH 和Holo-GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 的“熔点”为62.5℃。C,兔肌Apo-GAPDH 的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH 的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH 小得多,蛇肌Apo-GAPDH 活力损失一半的时间(t_(1/2)为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH 小32倍,兔肌GAPDH 小165倍,但蛇肌GAPDH 仍比兔肌GAPDH 稳定。蛇肌GAPDH 与兔肌GAPDH 的最适pH 相同,pH 稳定性蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH 的pH 稳定范围在pH6.1～8.1。ATP 在0℃也引起蛇肌GAPDH 失活,失活速度比兔肌GAPDH 小。结果表明蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH和Holo-GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH的“熔点”为62.5℃,兔肌Apo-GAPDH的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH小得多,蛇肌Apo-GAPDH活力损失一半的时间(t_(1/2))为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH小32倍,兔肌GAPDH小165倍,但蛇肌GAPDH仍比兔肌GAPDH稳定。蛇肌GAPDH与兔肌GAPDH的最适pH相同,pH稳定性蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH强。蛇肌Apo-GAPDH在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH的pH稳定范围在pH6.1～8.1。ATP在0℃也引起蛇肌GAPDH失活,失活速度比兔肌GAPDH小。结果表明蛇肌GAPDH比兔肌GAPDH稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

胍和脲溶液对氨基酰化酶活性和构象的影响

 本文研究了不同浓度盐酸胍和脲溶液对猪肾氨基酰化酶活性和构象的影响。研究结果表明,在低浓度的胍和脲溶液中(小于2mol/L),酶分子的整体构象变化的程度与活力变化的程度基本是平行的;而在高浓度的胍和脲溶液中(2mol/L以上),失活程度稍大于构象变化的程度。这些结果与分子量和亚基组成基本相同,但不含金属配基的肌酸激酶的结果,以及小分子量的胰凝乳蛋白酶和牛胰核糖核酸酶的结果相比较来看,可以认为配基锌离子的存在对酶分子的活性部位区域构象的稳定作用有一定的贡献,致使氨基酰化酶的活性部位的构象状态不象后三种酶那样脆弱。同时,我们还发现锌离子的存在对酶分子整体构象的稳定性上贡献很小。     

蛇肌果糖1,6—二磷酸酯酶的R态和T态的构象

几种高活性形式的蛇肌果糖１,６－二磷酸酯酶的紫外差光谱与酶在尿素或盐酸胍中差光谱相似,它们的酶学性质及巯基暴露的程度各不相同,提示这些高活性形式的酶的构象呈稳定的松驰状态,构象松驰的程度也各不相同,受果糖２,６－二磷酸、ＡＭＰ的过量底物抑制的酶处于帮种不同的低活性状态,它们的构象特征与Ｒ态相反,提示此三种低活性酶构象处于较紧凑状态,这几种Ｔ态酶巯基暴露的程度,受蛋白水解酶限制性酶解的速度不同,说明     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究 Ⅰ.纯化和一些基本性质

用硫酸铵分级、DEAE-纤维素柱层析、羧甲基纤维素柱层析分离和纯化了蛇肌GAPDH。聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳均为一条带。用此法提纯的蛇肌GAPDH A_(280)/A_(260)为2.1,是Apo-GAPDH。在纯化的Apo-GAPDH中加入NAD~ 能够得到结晶。Sephadex G-150凝胶过滤法测得蛇肌GAPDH的分子量约为150,000。十二烷基硫酸钠凝胶电泳也为一条带,亚基分子量约为38,000。表明蛇肌GAPDH是由相同的四个亚基组成的。用Ferdinand法测得比活为100。蛇肌GAPDH的N-末端氨基酸为缬氨酸。每分子含巯基数、色氨酸和酪氨酸残基数分别为12、12和36。重量法测得蛇肌Apo-GAPDH消光系数E_(280)~(0.1%)为0.775;Holo-GAPDH的消光系数E_(280)~(0.1%)为1.02。蛇肌GAPDH对甘油醛-3-磷酸的米氏常数为1.67×10~(-3)M,对NAD~ 的米氏常数为1.11×10~(-4)M。NAD~ 与蛇肌Apo-GAPDH结合后有Racker带,每分子蛇肌GAPDH可结合4分子NAD~ ,酶与NAD~ 的结合表现为负协同性。蛇肌GAPDH的圆二色谱,近紫外区Apo-GAPDH在285nm处有一负峰,292nm、270nm处有肩。加入NAD~ 后负峰变大并且蓝移。NAD~ 的加入似乎影响了酪氨酸所处的微环境。远紫外区Apo-GAPDH在220nm处有一负峰,208nm处有一个肩;加入NAD~ 后,负峰值稍稍变大,但峰的位置和形状未变。表明蛇肌GAPDH中,含较多的β-折迭,较少的α-螺旋。NAD~ 的加入对二级结构影响不大。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅰ.纯化和一些基本性质

用硫酸铵分级、DEAE-纤维素柱层析、羧甲基纤维素柱层析分离和纯化了蛇肌GAPDH。聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳均为一条带。用此法提纯的蛇肌GAPDH A_(280)/A_(260)为2.1,是Apo-GAPDH。在纯化的Apo-GAPDH 中加入NAD~ 能够得到结晶。Sephadex G-150凝胶过滤法测得蛇肌GAPDH 的分子量约为150,000。十二烷基硫酸钠凝胶电泳也为一条带,亚基分子量约为38,000。表明蛇肌GAPDH 是由相同的四个亚基组成的。用Ferdinand 法测得比活为100。蛇肌GAPDH 的N-末端氨基酸为缬氨酸。每分子含巯基数、色氨酸和酪氨酸残基数分别为12、12和36。重量法测得蛇肌Apo-GAPDH 消光系数E_(280)~(0.1)%为0.775;Holo-GAPDH 的消光系数E_(280)~(01.)为1.02。蛇肌GAPDH 对甘油醛-3-磷酸的米氏常数为1.67×10~(-8)M,对NAD~ 的米氏常数为1.11×10~(-4)M。NAD~ 与蛇肌Apo-GAPDH 结合后有Racker 带,每分子蛇肌GAPDH 可结合4分子NAD~ ,酶与NAD~ 的结合表现为负协同性。蛇肌GA PDH 的圆二色谱,近紫外区Apo-GAPDH 在285nm 处有一负峰,292nm、270nm 处有肩。加入NAD 后负峰变大并且蓝移。NAD~ 的加入似乎影响了酪氨酸所处的微环境。远紫外区Apo-GAPDH 在220nm 处有一负峰,208nm 处有一个肩;加入NAD~ 后,负峰值稍稍变大,但峰的位置和形状未变。表明蛇肌GAPDH中,含较多的β-折迭,较少的α-螺旋。NAD~ 的加入对二级结构影响不大。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶激活和抑制状态的进一步研究

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶(FruP_2ase)在K~+存在下或经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶限制性酶解后,其中性pH的活力均有2倍或2倍以上增加。三种高活性形式的酶其紫外差光谱都同酶在尿素中的差光谱峰形基本一致。它们在受底物抑制的阈值、Mg~(2+)活化行为、K_m值、最适pH、同DTNB反应的能力以及巯基修饰后酶活力的变化等方面均有明显不同。说明三种高活性形式的酶构象呈松弛状态,但是在构象上是有差别的。受AMP抑制的酶2个快速反应巯基被DTNB修饰后,其pH7.5活力增加到对照酶活力的2.5倍,在这种条件下可反应的总巯基数为4,这时酶仍可保持在高活性状态。而底物抑制的酶,则观察不到快反应巯基,这种条件下,可反应的总巯基数为14。说明受AMP抑制的酶的构象比受底物抑制的酶的构象更为紧凑。     

有机溶剂对缢蛏碱性磷酸酯酶分子构象和催化活力的影响

本文初步研究了三种有机溶剂甲醇、二甲基甲酰胺、二氧六环对缢蛏碱性磷酸酯酶(ALP)分子构象和催化活力的影响。发现在有机溶剂作用下,ALP的荧光发射光谱、紫外差光谱、园二色光谱都发生了显著的变化,而酶经甲醇、二甲基甲酰胺预处理后酶活力提高,经二氧六环预处理后活力下降,但当测活体系中有三种有机溶剂存在时,酶的活力却被大大抑制。     

蛇肌果糖1，6－二磷酸酯酶的R态和T态的构象

几种高活性形式的蛇肌果糖１,６－二磷酸酯酸的紫外差光谱与酶在尿素或盐酸胍中差光谱相似,它们的酶学性质及巯基暴露的程度各不相同,提示这些高活性形式的酶的构象呈稳定的松驰状态（Ｂ态）,构象松驰的程度也各不相同。受果糖２,６－二磷酸、ＡＭＰ和过量底物抑制的酶处于三种不同的低活性状态,它们的构象特征与Ｒ态相反,提示此三种低活性酶构象处于较紧凑状态（Ｔ态）。这几种Ｔ态酶流基暴露的程度,受蛋白水解酶限制性酶解的速度不同,说明这些Ｔ态酶的构象的紧凑程度是有差异的。蛇肌酶的不同的活化状态所具有不同的稳定的构象状态,在能量上可能相差很小,便于受到多种因子的调节。这可能是别构酶所普遍具有的现象。     

甲醇对胰蛋白酶催化活性影响的机理研究

为了探索甲醇影响胰蛋白酶催化活性的作用机理,将胰蛋白酶纯化到电泳纯的水平,用纯酶进行了催化动力学研究;测定了酶分子的紫外吸收光谱、紫外差示光谱和荧光发射光谱的变化.试验结果表明:胰蛋白酶经7%甲醇处理时,其比活力比对照提高了17.97%.经甲醇处理后的胰蛋白酶,其动力学参数Km值及Vmax值均得到提高,且Vmax提高幅度比较大.甲醇处理后,酶的紫外吸收光谱基本没有变化,其差示光谱出现明显的正峰和负峰,而其荧光发射光谱也基本不变,只是荧光强度有所增加.实验结果证明,在7%甲醇存在下,胰蛋白酶分子构型不变,酶活性的变化是甲醇引起酶分子构象改变的结果.     

截流荧光法研究米曲霉氨基酰化酶的快速胍变性动力学

 用荧光光谱法、截流荧光法和酶活力测定法研究了在盐酸胍溶液中米曲霉氨基酰化酶变性动力学。我们发现在4.8mol/L盐酸胍溶液作用下(0.05mol/L磷酸缓冲溶液,pH7.4,25℃),氨基酰化酶二聚体解离成单亚基过程是一个十分快速的过程,反应速率常数k为3361l/s,即约需3ms时间完成;而单亚基分子的构象变化需要约20min方能到达平衡态,这是一个逐渐变化的缓慢过程。酶分子在胍作用下的失活现象同酶分子的结构变化紧密相关,在胍浓度大于4mol/L时酶完全失活。在高浓度盐酸胍下酶失活主要是因为酶二聚体迅速解离成单亚基的过程和单亚基构象逐渐变化的缓慢过程。双亚基解离常数大小标志着酶分子亚基间作用力的强弱。