白木香AsFPS1启动子的克隆及功能的初步分析

本研究利用白木香(Aquilaria sinensis)同属植物Aquilaria agallocha的基因组数据,获得一条具有与白木香法呢基焦磷酸合酶基因(AsFPS1)相似性极高的基因序列,并克隆了该基因的起始密码子(ATG)上游1 226 bp处的启动子序列。该序列中AT含量为63.03%,与启动子特征相符。预测的转录起始位点位于起始密码子ATG上游73 bp处,除了具有CAAT-BOX和TATA-BOX等真核生物启动子核心元件外,还存在ARE,Box I,G-Box,ACE等厌氧诱导顺式作用元件和光应答元件。该序列能够驱动GUS的表达,具有启动子的活性,茉莉酸甲酯和赤霉素两种激素处理可显著地增强该启动子活性。本实验为进一步研究AsFPS1基因的表达及调控机制研究提供了一定的理论依据。     

拟南芥VHA-c3启动子的GUS基因融合表达

VHA-c3基因是拟南芥液泡H+-ATPase c亚基的5个同源基因之一,已有研究结果表明其与植物抗非生物胁迫有关。本论文在克隆不同长度VHA-c3基因上游调控序列的基础上,利用GUS报告基因,研究了VHA-c3基因的植物组织及器官定位。结果表明：VHA-c3起始密码子上游772bp的序列内存在着VHA-c3基因的基本启动子元件,可指导基因组成型表达在拟南芥的叶片、表皮毛、叶柄、根、雄蕊、柱头和萼片;在VHA-c3起始密码子ATG上游2812bp-2234bp片段和1496bp-772bp片段中各存在一个负调控元件,在2234bp-1496bp片段中存在一个正调控元件,它们的存在可控制基因在气孔中的表达。     

胡杨PeNAC121基因启动子的分离鉴定和胁迫应答模式分析

为了探究NAC转录因子家族成员在胡杨（Populus euphratica）逆境胁迫中的响应和调控机制,利用PCR技术从胡杨中克隆了PeNAC121基因的启动子序列,并采用生物信息学工具对该启动子的结构特征进行了分析,最后利用该启动子驱动GUS报告基因在三倍体毛白杨（Populus tomentosa）中表达,并对获得的转基因植株采用不同胁迫处理后进行了GUS染色和酶活性定量分析。结果表明,克隆获得的PeNAC121基因的启动子长度为1 997 bp（起始密码子ATG上游）,启动序列中除了含有大量的光响应元件,还含有多个与非生物逆境胁迫和激素响应相关的元件,如低温响应元件LTR、干旱响应元件MBS、防卫和胁迫响应元件TC-rich repeats、脱落酸（ABA）响应元件、以及赤霉素（GA）响应元件等。基因的组织表达模式检测结果显示,PeNAC121基因主要在茎中表达,在根和叶中的表达较少。GUS组织化学染色和酶活性检测结果表明,胡杨PeNAC121启动子显著受到NaCl、甘露醇、ABA和4 ℃低温的诱导表达。由上述结果推测PeNAC121基因与胡杨的逆境胁迫应答密切相关,表明该基因的启动子是一个能够应答多种逆境胁迫的诱导型启动子。本研究为阐明PeNAC121基因在胡杨逆境响应和调控中的作用机制提供理论参考。     

从水稻细胞质型果糖-1,6-二磷酸酶启动子上游中去除93 bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖-1,6-二磷酸基因ATG上游1 195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻(Oryza sativa L.)中特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件.为了研究其调控特异表达的顺式元件,对启动子5′端进行了一系列的缺失,得到4种与GUS基因融合的植物表达载体,通过基因枪法转入水稻.结果表明,自启动子5′端-1 195 bp缺失至-1 102 bp时,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达,且表达活性有所提高,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件.进一步缺失仍然保持组成性表达的模式,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达,同时启动子活性有所提高.这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力.     

花生ARAhPR10基因启动子序列的克隆及分析

PR10(pathogenesis-related class10protein)类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性(SAR)有着紧密联系,本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗黄曲霉花生品种粤油20中克隆ARAhPR10(Aspergillus flavus-resistant AhPR10)基因起始密码子ATG上游256bp类似启动子序列,并对其进行植物顺式作用元件数据库PLACE预测分析。结果表明,该类似启动子序列含有4处TATA box和2处CAAT box保守的启动子结构元件,还有6处W-box、1处BIHD1和3处GT-1motif抗逆应答元件,其中W-box常见于PR蛋白的启动子区内参与病程应答。我们初步认为本研究克隆的序列可能是ARAhPR10基因的启动子。     

从水稻细胞质型果糖—1，6—二磷酸酶启动子上游中去除93bp可以彻底改变其表达模式

细胞质型果糖_1,6_二磷酸基因ATG上游 1195bp侧翼序列可调控GUS基因在水稻 (OryzasativaL .)中特异性表达 ,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式元件。为了研究其调控特异表达的顺式元件 ,对启动子 5′端进行了一系列的缺失 ,得到 4种与GUS基因融合的植物表达载体 ,通过基因枪法转入水稻。结果表明 ,自启动子 5′端 - 1195bp缺失至 - 110 2bp时 ,GUS基因由叶肉细胞特异性表达变为组成型表达 ,且表达活性有所提高 ,推测在该区段中存在调控叶肉细胞特异性表达的顺式元件。进一步缺失仍然保持组成性表达的模式 ,即在转化株的根、茎和叶中的所有细胞中均有表达 ,同时启动子活性有所提高。这一结果暗示该启动子具有很大的应用潜力。     

百子莲脱水素基因ApY2SK2逆境应答模式及启动子调控功能研究

在百子莲胚性细胞中筛选到对超低温保存复合逆境具有积极响应的保护类蛋白脱水素(ApY_2SK_2),为探明ApY_2SK_2基因在复合逆境中的应答模式,该研究采用染色体步移技术克隆并分析了ApY_2SK_2编码基因上游1 200 bp的启动子序列。结果表明:(1)序列分析显示,该启动子含有多个与逆境和激素诱导相关的顺式调控元件;实时荧光定量PCR结果表明,ApY_2SK_2基因的表达具有组织特异性,在百子莲的叶和果中表达量较高,且在多种胁迫处理与ABA激素诱导下,其表达量显著升高。(2)成功构建了5个ApY_2SK_2启动子不同缺失片段驱动GUS基因的融合表达载体,经农杆菌转化、抗性筛选和PCR检测鉴定,获得T_3代纯和转基因拟南芥株系。(3) GUS组织化学染色结果显示,GUS基因在拟南芥幼苗全株、成年苗的叶、花和成熟果实中表达活性较强,但在未成熟果实中无明显表达;烟草瞬时表达结果显示,与对照组相比,在脱水胁迫和ABA处理下的ApY_2SK_2启动子不同缺失片段驱动GUS基因表达具有显著差异。(4)转基因拟南芥GUS活性测定结果显示,ApY_2SK_2启动子MBS元件和ABRE元件可响应干旱与渗透胁迫信号;ApY_2SK_2启动子LTR元件参与低温响应;ApY_2SK_2启动子-1 199～-262 bp区域包含多个串联的ABRE顺式调控元件(-373～-211 bp)对响应ABA信号具有主要调控作用。该研究结果揭示了ApY_2SK_2启动子的组织特异性,且启动子上的关键顺式调控元件对不同的胁迫和激素信号响应具有决定性调控作用。     

油葵种子特异启动子Ha ds10 G1的克隆及功能鉴定

从油葵中克隆得到LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因的启动子序列,并对其进行功能分析。利用PCR技术从油葵品种"矮大头"基因组DNA中分离Ha ds10 G1基因上游的调控序列,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p BI121-PHa ds10,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、RT-PCR和GUS组织化学分析,以检测GUS基因在转基因烟草中的表达情况。结果表明,油葵Ha ds10 G1基因启动子长度为1 417 bp,与已报道的向日葵Ha ds10G1基因启动子序列同源性为89.42%。作用元件分析发现该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如RY重复元件、ABRE元件、TC-rich元件等。转基因植株的PCR结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,该启动子序列仅能够驱动GUS基因在烟草种子表达,而在根、茎、叶等组织中均未检测到GUS基因表达。因此,油葵LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因上游1 417 bp片段具有种子特异性启动子功能。研究结果为油葵等油料作物的油脂遗传改良提供组织特异性启动子。     

水稻OsNRT1-d启动子的分离和功能分析

采用PCR技术,从水稻基因组中分离到OsNRT1-d读码框上游2 019 bp序列.序列分析表明:在起始密码ATG上游-189 bp和-127 bp处分别存在CAAT-box和TATA-box,具有典型的启动子结构.推测的转录起始位点CAC位于起始密码ATG上游-93 bp处.将OsNRT1-d启动子5′-端系列缺失后,分别与GUS报告基因融合,获得的NRT2019∷GUS、NRT1196∷GUS 和NRT719∷GUS转基因载体.农杆菌介导转化水稻,获得的转基因水稻均能启动下游GUS报告基因在水稻的根、叶、花颖和种子中表达;将转基因水稻幼苗放在滤纸上紧急干旱处理和用15% PEG6000进行模拟干旱处理,GUS基因的表达量明显升高,且干旱应答元件在-719 bp～-1 bp的范围内;GUS活性分析表明:OsNRT1-d启动子对ABA、NaCl、(NH4)2SO4、KNO3和Gln等信号没有应答反应.     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

一种狂犬病毒疫苗佐剂的制备及其免疫效果研究

目的:以角鲨烯、山梨醇、吐温为组分,在琥珀酸缓冲液中混和甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白制备复合佐剂Nano-fla,评价该佐剂对人二倍体狂犬疫苗的免疫效果和安全性。方法:以人二倍体细胞制备的狂犬灭活疫苗为抗原,BALB/c小鼠设置PBS对照组、全剂量疫苗组、半剂量疫苗组、低剂量佐剂组(含半剂量抗原+5μg鞭毛蛋白)、中等剂量佐剂组(含半剂量抗原+10μg鞭毛蛋白),免疫程序为在0、3、7 d肌肉注射,并在首针免疫后的第7、14 d尾静脉采血分离血清,通过快速免疫荧光灶抑制实验检测中和抗体,通过酶联免疫斑点实验检测细胞因子水平。结果:首针免疫后第7 d,中等剂量佐剂组的中和抗体达保护效力水平,显著高于全剂量疫苗组和低剂量佐剂组;第14 d时中等剂量佐剂组的IgG抗体浓度显著高于全剂量疫苗对照组;第14 d中等剂量佐剂组与全剂量疫苗组相比,分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数量显著增加。结论:复合佐剂Nano-fla应用到狂犬疫苗中,能有效刺激小鼠体液免疫和细胞免疫应答,更早地产生中和抗体,且能有效降低抗原用量,具有潜在应用价值。     

干旱胁迫和复水对浙江楠光合与根系生长的影响

为探索珍贵树种斑块化混交造林的可行性, 以浙江楠为研究对象, 通过干旱胁迫和复水试验, 分析其光合生理特征、根系生长和抗氧化系统的响应。结果表明, 对照条件下浙江楠的光合生理最优, 重度干旱严重影响浙江楠的生理进程, 具体表现为光合能力、光适应特征、瞬间气体交换参数和叶绿素荧光参数的显著下降, 其光合速率的下降是由气孔因素导致; 中度干旱条件下的浙江楠植株水分利用率最高, 重度干旱条件下的水分利用率与对照、中度干旱相比较, 分别下降了29.6%和46.4%; 中度干旱条件下根半径下降, 但SOD、POD和CAT未显著下降, CAT均值略有上升, 重度干旱条件下的3种保护酶均表现出显著下降, 抗氧化酶已不能有效清除掉活性氧物质。因此, 浙江楠具备一定的抗旱能力, 中度干旱并不影响浙江楠的正常生长, 在实际斑块化造林过程中, 可适度控制土壤含水量, 有利于在不同树种斑块化混交配置应用中提升浙江楠造林的成活率和保存率。     

云南短头熊蜂的繁育特性研究

短头熊蜂Bombus breviceps是云南省优势蜂种,为更好地挖掘本土熊蜂资源,繁育农业授粉蜂群,本研究从云南3个地区（屏边、个旧和昆明）收集短头熊蜂蜂王后,在相同条件下饲养,统计分析其蜂王产卵前期、工蜂发育期、蜂群生长特性、群势、产卵蜂王率及蜂群可应用率等繁育特性指标。结果表明：3个地区工蜂的发育期相同,屏边地区的蜂王产卵前期最长,蜂群始见工蜂时间及工蜂数量达到6头、30头和60头的时间也最长,均显著高于个旧地区和昆明地区（P<0.05）。3个地区短头熊蜂的群势差异不显著（P>0.05）,但昆明地区的工蜂数量最少,显著低于屏边地区和个旧地区（P<0.05）,而子代蜂王数量显著高于屏边地区和个旧地区（P<0.05）,雄性蜂数量显著高于屏边地区（P<0.05）。昆明地区的产卵蜂王率和蜂群可应用率高于屏边地区和个旧地区。总体而言,云南的短头熊蜂群势强,产卵蜂王率75%以上,蜂群可应用率均在63%以上,易于人工繁育,具有重要的授粉利用价值。     

不同冻存条件对甘蔗原生质体活力和再生能力的影响

为了获得活力高和再生能力强的甘蔗原生质体,该文对甘蔗原生质体的冻存液浓度、冻存温度和冻存部位进行了研究。结果表明:(1)不同的冻存液、不同的冻存温度和不同的取材部位原生质体冻存后复苏对甘蔗原生质体的活力影响有显著差异性,三个冻存液组合比较,在组合2(70%培养基+20%血清+10%DMSO),冻存30 d后复苏活力最强,高达72%;冻存90 d内复苏,-196℃液氮和-80℃冰箱冻存,甘蔗原生质体的活力差异不显著,活力均在75%以上,但90 d冻存后复苏,-196℃液氮冻存后复苏比-80℃冰箱冻存冻存后复苏原生质活力强;不同取材部位比较,幼叶冻存30 d后复苏所得原生质体活力较高(达79. 2%),茎尖冻存30 d后复苏所得原生质体活力仅为42.7%。(2)不同的冻存液和不同的冻存温度,细胞第一次启动分裂和形成细胞团的时间差异不显著,一般培养5～6 d,细胞壁基本形成完整,培养6 d后,细胞启动分裂,培养15 d后形成细胞团。不同的材料部位相比较,茎尖酶解所得原生质体再生能力最强,较幼叶酶解原生质体,形成细胞壁的时间早3 d,第一次分裂时间早2 d。     

江永普通野生稻遗传多样性和籼粳基因频率监测分析

以栽培稻的8个籼-粳测验种为对照,采用39对SSR引物检测了江永野生稻居群在1982年、2008年、2017年的遗传多样性,采用38对In Del引物检测了江永野生稻居群在1982年、2008年、2017年的籼-粳基因频率。结果表明:在1982年取样保存在异位圃的40份样本的遗传多样性稍高于2008年、2017年原位保护区样本的遗传多样性;2008年取的样本数虽然比2017年多,但两次取的样本之间遗传多样性几乎没差异。不同年份取的样本之间的遗传分化系数Fst都很小,基因流Nm都较大,分化不明显。通过聚类分析和主坐标分析(PCo A),发现野生稻居群与4份栽培粳稻聚为一类,4份栽培籼稻单独聚成一类,显示江永野生稻与粳稻的血缘近于籼稻;籼-粳基因频率的分析表明,野生稻样本多属粳稻型,少数属偏粳稻型,原位保护区的偏粳稻类型单株数占取样单株总数的比例,2008年比1982年的增加了10.0%,2017年比2008年的增加了1.6%,显示江永野生稻原位保护区生境条件有利野生稻从粳稻型向偏粳稻型变异,随着野生稻产生环境适应性变异,籼型基因频率在提高。     

单增李斯特菌lmo2192基因克隆与表达

[目的]对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2192基因进行克隆及原核表达。[方法]利用PCR方法扩增lmo2192基因,连接p MD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。构建重组表达质粒p ET32a-2192,将其转入大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达,利用SDS-PAGE与Western Blotting鉴定重组蛋白。[结果]扩增lmo2192基因序列长度为969 bp,与预期一致。该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定分析该产物为56 k Da左右的融合重组蛋白,与预期大小一致。[结论]成功克隆lmo2192基因,并获得大量表达,为进一步研究该基因功能奠定理论基础。     

湖北黄石典型水域超微型真核浮游生物多样性研究

为探讨湖北省黄石市典型水域中超微型真核浮游生物多样性, 采用18S rDNA 扩增片段限制性酶切技术, 结合优势类群测序及相关统计学分析, 对2015年夏季湖北黄石境内营养程度不同的典型水域(长江, 磁湖, 青山湖, 青港湖)中超微型真核浮游生物的群落组成及遗传多样性进行了研究。结果表明, 4个水域的超微型真核浮游生物多样性有明显差异, 多样性随水域营养化程度的增高而降低。优势克隆的测序结果显示, 优势类群藻类包括隐藻、绿藻、甲藻, 真菌包括隐真菌和壶菌, 此外还有纤毛虫及未分类的浮游生物, 隐藻在4个水域中都占优势。不同水域的优势类群差别较大。优势类群的种类随水域营养化程度的增加而减少。群落的多样性与总磷呈极显著的负相关。     

蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(Ⅵ)还原效果研究

为了提高蜡样芽孢杆菌CP-1菌株对Cr(Ⅵ)的还原效果,采用单因素和正交试验,通过摇瓶发酵培养,对影响蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(Ⅵ)的发酵培养基成分和培养条件进行了优化,并研究了最佳发酵条件下的蜡样芽孢杆菌CP-1对Cr(Ⅵ)的还原效果。结果表明,蜡样芽孢杆菌CP-1菌株还原Cr(Ⅵ)的最佳培养基组成为:1%甘露醇, 3%的大豆蛋白胨, 0.05%KCl, 0.1%CuSO4,在此基础上的最佳培养条件为:pH7.0、6%接种量、45℃培养3 d,在此条件下,Cr(Ⅵ)初始浓度为100mg·L^-1时,对Cr(Ⅵ)的还原率达99.75%。在Cr(Ⅵ)污染的土壤中添加蜡样芽孢杆菌CP-190d后,土壤中的Cr(Ⅵ)含量降低55.15%左右。     

AG1478抑制剂对白鲫体色发育的影响

鱼类的体色由基本色素细胞相互配合而成,色素细胞主要有4种类型:黑色素细胞、红色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞。AG1478是针对酪氨酸激酶(Tyr)的一种新型抑制剂。Tyr是黑色素生成过程中的关键酶,在黑色素细胞中呈特异性表达。本文主要阐述了白鲫四种色素细胞以及两种不同形态黑色素细胞的超微结构观察,探讨了AG1478抑制剂对白鲫早期体色发育的影响,实验结果表明抑制剂对白鲫早期体色发育没有明显影响。