双歧杆菌肽聚糖结构及分子量的分析

从双歧杆菌细胞壁中分离纯化肽聚糖,研究其化学成分、结构和分子量分析。经氨基酸、多糖和蛋白质含量分析和肽聚糖的溶解实验鉴定,所提取物质的主要成分为肽聚糖;经核磁共振和红外光谱分析,所提取肽聚糖的结构与已知的肽聚糖的结构相吻合,其糖链结构为由D型吡喃糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸以β-1,4-糖苷键连接而组成;经SDS-PAGE和多种染色方法结合,分析经溶菌酶水解后的肽聚糖,其分子量的分布呈弥散状,范围在97.6kD到14.4kD之间。     

霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统的效应蛋白对细菌细胞壁的降解机制

【背景】肽聚糖(Peptidoglycan,PG)是细菌细胞壁的重要组成部分,而霍乱弧菌Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ Secretion System,T6SS)可以分泌具有肽聚糖水解酶活性的效应蛋白到受体细菌中杀死细胞,这类水解酶的作用机制尚未研究清楚。【目的】通过对细菌细胞壁的PG成分进行研究,建立细胞壁PG成分分析方法,并对霍乱弧菌T6SS分泌的2个破坏细胞壁的效应蛋白TseH和VgrG3的作用机制进行解析。【方法】使用显微镜观察TseH和VgrG3异位表达对宿主细菌生长的影响;纯化大肠杆菌细胞壁,使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察提纯的细胞壁形态;使用纯化的TseH和VgrG3分解消化PG,利用超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra-Performance LiquidChromatography-Time-of-FlightMassSpectrometry,UPLC-TOFMS)分析鉴定消化后的产物成分;通过分析结果推导结构。【结果】通过透射电子显微镜观察,发现提纯的PG呈现半透明的薄膜泡状;通过UPLC-TOFMS的分析以及逆向推导,得到了提纯的PG被VgrG3水解酶降解之后的3种主要产物,分别是二糖二肽(Disaccharide,Di)、二糖三肽(Disaccharide Tripeptide,Tri)和二糖四肽(Disaccharide Tetrapeptide,Tetra)。【结论】建立了提纯PG和UPLC-TOFMS分析PG成分的方法,揭示了效应蛋白VgrG3而非TseH可以降解PG多糖链N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β(1-4)糖苷键的功能。由于攻击细胞壁的效应蛋白在革兰氏阴性细菌中广泛存在,本研究不仅为鉴定这类重要效应蛋白的功能提供了有效的方法,而且对研究靶向细胞壁的新型抗生素也有重要的指导作用。     

培养基成分对口腔福赛类杆菌生长影响的研究

目的比较不同培养基成分对福赛类杆菌ATCC43037生长的影响,寻找一种有效促进福赛类杆菌生长的培养基.方法将福赛类杆菌ATCC430 37 接种到5种不同培养基(包括琼脂板和液体培养基)中,在厌氧培养箱内37℃厌氧培养7 d,观察平板上菌落生长情况,在λ=550 nm处每24 h测定液体培养菌液A值.细菌通过革兰染色和PCR法鉴定.结果1.生长在血平板上的福赛类杆菌ATCC43037菌落形态呈粉红色或白色小斑点状,在以BHI 为基础培养基中添加氯化血红素、维生素K3、N-乙酰胞壁酸的No2血琼脂培养基生长最好,而在无氯化血红素、维生素K3及血的No4琼脂板上不生长.2.福赛类杆菌ATCC43037在以TSB 为基础培养基中添加酵母提取物、植物蛋白胨、氯化血红素、维生素K3、N-乙酰胞壁酸和D TT的No1液体培养基生长最好,培养7 d后A值＞0.8,在缺乏N-乙酰胞壁酸的No5液体培养基中几乎不生长.3.菌落细菌革兰染色为G 梭状杆菌,PCR法鉴定为福赛类杆菌.结论福赛类杆菌在血平板和液体培养基中存在不同的生长特性,N-乙酰胞壁酸是福赛类杆菌在液体培养基中生长最重要的成分,DTT有益于细菌生长.     

人源溶菌酶结构与功能的研究进展

人溶菌酶是一类人体内天然存在的能够溶解细菌细胞壁的碱性蛋白的总称。其作用特征是能够裂解肽聚糖中的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰氨基甲酸之间的β-(1,4)-糖苷键。人溶菌酶具有抗菌、抗炎、抗病毒和增强免疫力等多种特性,因此在国内外市场上应用广泛。本文就人溶菌酶的结构特点、表达部位、功能表达以及应用情况进行综述。     

大肠杆菌细胞壁肽聚糖的化学修饰及荧光标记

【目的】发展一种活细菌细胞壁荧光标记方法,为后期研究细菌肽聚糖的生物合成和代谢规律以及其与细菌感染致病的关系提供新的工具。【方法】对细菌肽聚糖的生物合成前体N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1-P)进行化学修饰,设计并合成含有叠氮基的GlcNAc-1-P类似物(化合物5:Ac3GlcNAz-1-P)。将该类似物与细菌共同孵育,使其作为探针进入细菌肽聚糖天然合成途径。之后提取并酶解肽聚糖组分,用红外光谱(FTIR)和液质联用(LC/MS)检测探针是否通过代谢进入细菌肽聚糖结构中。同时用外源荧光素对代谢掺入细菌肽聚糖中的探针进行染色。在激光共聚焦显微镜下观察对活细菌的荧光标记效果。【结果】通过四步有机合成反应,以79%的总收率成功获得了化合物5。将大肠杆菌(Escherichia coli BL21)作为模式菌株与化合物5共孵育后,其肽聚糖组分的LC/MS和FTIR分析结果均显示探针可以被细菌利用并被代谢掺入到肽聚糖结构中。激光共聚焦显微镜观察结果显示,荧光素可以高效标记表面携带有生物正交探针的大肠杆菌。【结论】设计合成了一种新型探针,可用于活细菌成像,为深入研究细菌肽聚糖的生物学功能及其与细菌感染致病的关系提供了一种简便的方法。     

麦胚凝集素的结构及与专一性糖的相互作用

麦胚凝集素(WGA)分子由两个相同原体组成。WGAⅡ的原体为一条171个氨基酸残基的多肽链,肽链可分成四段,各段氨基酸顺序呈明显同系现象,折叠成形态相似的结构域。WGA的高级结构有明显对称性。二原体交界处有两对糖结合部位,能借氢键和疏水相互作用特异地结合N-乙酰葡糖胺和N-乙酰神经氨酸及其衍生物和寡聚糖。WGA与某些细胞上依赖糖的受体作用引起生物效应,其特殊的空间结构是重要的。     

肽链及蛋白质N-末端羰酰荧光衍生物的形成

短肽及胰岛素的N-末端经Dixpn转氨后具有荧光发色性质,其激发与发射波长随肽链氨基酸残基的种类和数量的不同而有差异,其范围大约为Ex 312—333nm;Em 398—408nm;量子产率为0.020—0.03.荧光发色团的基本化学结构可能是N-末端α-羰酰基及其相连的酰胺基,并且N-末端第二及第三位氨基酸残基对其荧光性质有影响.在碱性溶液中(pH>9.0)它的荧光强度降低,但在NaCl溶液中随盐浓度的增加而增强.在不同浓度的CuHCl溶液中,羰酰三肽的荧光强度变化随其氨基酸残基的种类和构型的不同而有差异.以上结果提示;α-羰酰荧光衍生物可能作为蛋白及肽N-末端的荧光探剂,可能成为研究蛋白和肽结构与功能的一种手段.     

肽链及蛋白质N-末端喹喔啉类荧光衍生物的形成

蛋白质及肽链N-末端经Dixon转氨后的羰酰基与邻苯二胺作用可形成喹喔啉类荧光衍生物.形成这一发色团的过程较为缓慢;喹喔啉短肽的激发(Ex 293-305nm)与发射(Em 360-365nm)波长随肽链氨基酸残基组成不同而有一定变化;喹喔啉胰岛素荧光衍生物的激发光波长为Ex318nm,发射波长为Em 353nm.喹喔啉三肽的荧光在乙二醇溶液中的变化因其氨基酸残基组成的不同而有差异.以上结果提示:喹喔啉类荧光衍生物可能作为研究蛋白和肽结构与功能的一种手段.     

嗜酸热硫球菌的一些古细菌特征

本文报道了一株专性化能无机自养菌——嗜酸热硫球菌(Sulfosphaerellus thermoacido-philum)S-5菌株的某些生理生化和代谢特性。通过电子显微镜技术及其它分析方法研究发现,s一层代表了该菌细悃外被的唯一组成,并由规则排列的六边形亚单位构成,亚单位之间的中心距离为1;．3 nm。s一层的初步电泳染色分析表明,它主要由蛋白质组成,但不含糖蛋白。液相色谱分析查明,细胞外被中不含胞壁酸成份,即没有囊状的肽聚糖层。细胞脂类的红外光谱分析显示出醚键组份而不含酯键。在无细胞提取液中,没有河出卡尔文循环的关键酶——l,5一二磷酸核酮糖羧化酶。可见嗜酸热硫球菌固定coz的途径是不同于其它的硫氧化自养真细菌如氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxidans K)的。这些试验结果充分体现了嗜酸热硫球菌的古细菌特征。     

甲烷氧化细菌的电子显微镜观察

采用冷冻蚀刻、超薄切片和负染色电镜技术,对 Methylomonas sp. 761M和Methylosinus sp．81Z两抹甲烷氧化细菌的细微结构进行了观察。在冷冻蚀刻中,缅胞从质膜和细胞壁外膜的中央劈开,暴露出四个断裂面。各个断面的结构有所不同,显示出颗粒、小杆、乳状突起、小坑和光滑区等结构。冷冻蚀刻揭示的多层结构,与超薄切片和负染色观察结果一致。此外,对甲烷氧化细菌细胞壁表面图案,细胞内膜结构进行了观察。     

DGGE技术监测生物制氢反应器微生物群落结构和演替

为了研究生物制氢反应器微生物群落结构, 揭示混合菌群的生态学效能. 从连续流生物制氢反应器CSTR运行不同时期取活性污泥, 利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究了产氢混合菌群的多样性和动态变化. 研究表明, 反应器从启动到乙醇型发酵稳定的运行, 经历了明显的微生物群落结构演替过程, 28天后反应器微生物群落结构基本恒定, 形成顶级群落. 16S rDNA 序列同源性分析表明, 优势种群为低G + C含量革兰氏阳性细菌分支的Clostridium sp.和Ethanologenbacterium sp., b变形菌亚纲的Acidovorax sp., g变形菌亚纲的Kluyvera sp.和一些未被培养的拟杆菌群的细菌和螺旋体. 21天后产氢细菌Ethanologenbacterium sp., Clostridium sp. (Clostridiaceae bacterium 80 Kb)和一些未被培养的螺旋体群细菌的数量明显增加, 形成乙醇型发酵群落, 产氢量大幅度提高. 群落经过演替微生物多样性增强后降低, 在群落演替过程中一直存在的Clostridium sp., sp., Kluyvera sp.和未被培养的拟杆菌群等是构成群落结构的基本种群, 混合菌群之间存在着共代谢作用, 共同决定产氢效能.     

恶性疟原虫CTL抗原微表位基因重组疫苗的构建和免疫原性预测

选用中国人群常见的MHCⅠ类分子HLA-A2.1和HLA-B51限制性恶性疟CTL抗原表位, 构建了单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh,再将上述表位DNA序列串联,构建成双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts.将3种重组疫苗分别转染C1R/HLA-A2.1和K562/HLA-B51细胞后均证实表达.单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh的表达分别促进细胞表面HLA-A2.1和HLA-B51的稳定性.免疫共沉淀实验证实上述表位促进细胞表面HLAⅠ类分子组装,并提示特异性表位在细胞表面的递呈.双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts在以上两个不同细胞系中的表达与两个单表位微型基因的表达结果相似,证明双表位肽的串联编码构型不影响肽链中不同表位的特异性抗原递呈.这一研究结果为进一步设计具有广泛覆盖率的多表位恶性疟重组CTL疫苗提供了理论和实验基础.与常规体外CTL实验不同,本研究观察微表位基因在表达特定MHCⅠ类分子的人细胞中进行内源性抗原递呈的过程,其方法更接近人体内环境,对于人类CTL抗原表位的确定和人重组CTL表位疫苗免疫原性的预测具有重要意义.     

凝血因子Ⅸ/凝血因子Ⅹ结合蛋白家族的研究进展

凝血因子Ⅸ/Ⅹ结合蛋白家族是近来发现的C型动物凝集素超家族中一个亚家族.它们存在于蝰科蛇毒中,不具有酶活性,通过与凝血因子Ⅸ或凝血因子Ⅹ结合来延长凝血时间.在钙离子存在下结合在凝血因子Ⅸ/Ⅹ分子中γ-羧基谷氨酸区域.它们彼此之间具有很高的序列同源性,都是由两条同源的肽链通过一对二硫键相连.两条肽链都具有C型糖识别区的二硫键构型,各含一个钙离子结合位点.其中habu凝血因子Ⅸ/Ⅹ结合蛋白的晶体结构已经测定,除掉相互交叠的中心环外,两条肽链都具有类似于鼠甘露糖结合蛋白的结构.     

低双乙酰抗老化啤酒酵母工程菌的构建

用来源于啤酒酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和铜抗性基因（CUP1）取代质粒pLZ-2中α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）内部约2.3kb的DNA片段,构建成重组质粒pICG。限制酶酶切质粒pICG后获得在基因GSH1和CUP1两端含有ILV2序列的6.0kb的DNA片段。用此片段转化啤酒酵母YSF31,得到铜抗性高的转化子。并通过PCR和α-乙酰乳酸合成酶（AHAS）活性测定筛选到酵母工程菌。小试实验结果表明酵母工程菌谷胱甘肽含量比受体高34％,而双乙酰含量是受体的75％。其他发酵指标并没有发生改变。中试实验表明酵母工程菌发酵周期缩短3d,而且成品啤酒的保鲜时间延长50％。由于DNA操作过程中没有外源基因介入,因此啤酒酵母工程菌为生物安全的自克隆菌株,具有重要的实际应用价值。     

细菌群体异质性对生长动态过程的影响及其表征

在经典的表征群体生长的Logistic方程中, 假定群体中每个个体都是同质的. 解方程时的初值仅限定为N(t₀) = N₀, 因此, 对N₀相同而生理状态不同的接种物的生长动态不能区分. 事实上, 在菌群生长的任一时刻, 只有一定比例的细胞在进行分裂(设为θ), 这样, 不仅由N, 而且实际上由N和θ 共同决定. 因此, 解方程的初值条件还应加入θ (t₀) = θ₀, 而这又被在构建生长方程时所忽略, 但这一附加条件使Logistic方程的求解甚为复杂. 基于细菌生长过程的瞬时生长速率V_inst的时间过程曲线都呈Gauss分布形状这一特点, 在用瞬时生长速率成功地表征限制性条件下区分群体生长阶段的基础上, 进一步用Gauss分布近似函数表达式以求得异质性群体的生长参数, 这些参数可真实地表征不同生理状态细菌群体的生长动态, 为微生物学基础研究和在生物工程等方面的应用提供了一个新方法. 在此基础上提出了一个估算细菌群体生长延迟期和群体倍增时间的新方法.     

V型羊毛硫肽雷可肽的抑菌机制

【背景】雷可肽(Lexapeptide)为首例V型羊毛硫肽家族化合物,具有较好的抗革兰氏阳性菌活性,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和表皮葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis,MRSE)的抑制作用强于广泛应用的食品防腐剂乳酸链球菌素,其对pH和高温的稳定性也优于乳酸链球菌素,具有较好的应用前景。由于抑菌机制不明确,限制了雷可肽的开发应用。【目的】探究雷可肽抑菌作用特征以及作用机制,为雷可肽开发应用奠定基础。【方法】通过菌落计数法与Mg2+试验表征雷可肽抑菌动力学曲线;采用流式细胞仪和透射电子显微镜研究雷可肽在靶细胞表面的成孔性;利用高效液相色谱与基质辅助激光解吸电离的时间飞行质谱分析雷可肽处理对革兰氏阳性菌肽聚糖前体积累的影响。【结果】雷可肽在抑菌动力学上与乳酸链球菌素没有显著差别,但在更宽的Mg2+浓度范围内仍可保持抑菌活性。雷可肽处理后的细胞具有透过荧光染料的能力,生物型透射电镜观察到细胞发生破损。此外,在雷可肽作用后的细胞中检测到肽聚糖合成的前体尿嘧啶核苷二磷酸-N-乙酰胞壁酸五肽。【结论】雷可肽能够通过抑制细胞壁肽聚糖生物合成并造成细胞损伤进而获得通透性,以此来抑制革兰氏阳性菌生长。     

巨大芽孢杆菌α-淀粉酶基因核苷酸序列分析

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)AS1.127的淀粉酶基因的全碱基序列已被测定。结构基因由1982bp的单一开读框架组成。由DNA序列推测出的前体酶蛋白由659个氨基酸组成,N-端33个氨基酸为信号肽。成熟酶分子由626个氨基酸组成,分子量为68.676kD。该淀粉酶属糖化型α-淀粉酶。并与枯草杆菌(B.subtilis)168产生的糖化型α-淀粉酶之间有83.3%的同源性。分析发现两种菌产生的酶分子的N-端3/4的同源性为90.4%,而C-端1/4的同源性只有70%。序列排比结果说明在淀粉酶基因的趋异进化过程中,基因突变和遗传重组都曾起过作用。     

豌豆乙酰羟酸还原异构酶基因结构、蛋白活性分析及其调控机制研究

用PCR方法获得了G2豌豆AAIR基因的核DNA序列, 分析表明该基因由8个内含子和9个外显子组成, 其中3个内含子带有特征性的富A/T内源启动子区. 分子杂交试验表明, 短日照条件下G2豌豆中AAIR的表达不受生殖生长的影响, 开花前后都维持较高水平的表达. 长日照条件下, 植株开花后AAIR的表达水平迅速下降. AAIR基因表达强度的变化与豌豆乙酰羟酸还原异构酶的活性变化规律相一致. 用乙酰羟酸还原异构酶缺陷型大肠杆菌做功能互补实验发现, 带有豌豆AAIR cDNA的细菌能够在缺少分枝氨基酸的M9培养基上生长, 表明该基因产物确实具有乙酰羟酸还原异构酶活性. 进一步的研究表明, 豌豆AAIR基因产物能显著提高野生型大肠杆菌合成分枝氨基酸的能力. 凝胶阻滞实验表明, AAIR基因的内含子中的富A/T区能与豌豆核蛋白提取物发生特异性结合. 该蛋白在不衰老的短日照G2豌豆顶芽中一直保持稳定表达, 但在迅速衰老的长日照豌豆顶芽中, 开花后该蛋白就迅速降低直至完全消失. 因此, AAIR基因内源启动子区与核蛋白的特异性结合可能是调控该基因表达的重要机制.     

植物病原棒形细菌的RAPD分析

采用RAPD分析技术对萎蔫短小杆菌落葵致病变种（Curtobacterium flaccumfaciens pv. basellae pv. Nov.）和萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种（Curtobacterium flaccumfaciens pv. beticola pv. Nov.）及植物病原棒形细菌4个属的15个菌株进行分类研究：从50条随机引物中筛选出20条,共产生225条带,多态性条带占804%。遗传相似矩阵及UPGMA聚类分析,表明这两个新致病变种与萎蔫短小杆菌属亲缘关系近,最小相似系数为0.6511;与其他属细菌亲缘关系较远;结合前人研究结果对植物病原棒形细菌新近提出的分类地位的改变进行了探讨。     

溶氧反馈分批补料高密度培养人骨形成蛋白-2工程菌

对表达人骨形成蛋白2成熟肽的基因工程大肠杆菌E.coli DH5α/pDH-B²m在500mL摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,并在此基础上扩大至NBS Bioflo IV 20L发酵罐,利用溶氧反馈-分批补料培养技术：在培养过程中保持适当的溶解氧（40%）,以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基,使细菌保持适当的比生长率,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终菌体密度达OD₆₀₀=57,每升干菌量22.8 g,目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%,人骨形成蛋白2成熟肽的理论产率达到3.59 g/L。 