报告基因法比较两种放线菌启动子的活性

摘要：【目的】比较启动子Psf与红霉素抗性基因启动子（PermE*）在链霉菌中的表达强度差异。【方法】本文利用卡那霉素抗性梯度以及邻苯二酚2,3-双加氧酶显色系统,比较了两个启动子的表达差异。【结果】两个启动子在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus) NRRL3585、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）M145,委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ISP5230及变铅青链霉菌（Streptomyces lividans TK     

对羟基扁桃酸合酶基因的克隆表达及催化特性

【目的】比较两种不同来源基因重组的对羟基扁桃酸合酶(HmaS),考察其在大肠杆菌中的表达效率。【方法】分别对东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)来源的hmas进行异源表达,经离子交换层析和凝胶过滤色谱分离纯化获得HmaS,并检测HmaS的酶活和催化特性。【结果】来源于S.coelicolor的HmaSSC2比酶活是来源于A.orientalis的3.6倍;来源于A.orientalis的HmaSAO最适反应温度为28°C,在弱碱性条件下的酶活稳定性较好;来源于S.coelicolor的HmaSSC2最适反应温度为35°C,在28-45°C内保持较高的酶活,具有良好耐热性,在pH 7.0左右酶活最高,更易在偏中性的条件下发挥功能。【结论】HmaSSC2更适用于代谢工程改造大肠杆菌发酵法生产扁桃酸。     

桑氏链霉菌KJ40全基因组测序及分析

【背景】桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)KJ40是一株具有防病、促生多重功能的放线菌,有作为生物农药的潜力。目前还没有相关研究报道S.sampsonii全基因组序列,这限制了其功能基因、代谢产物合成途径及比较基因组学等研究。【目的】解析S.sampsonii KJ40的基因组序列信息,以深入研究该菌株防病促生机制及挖掘次级代谢产物基因资源。【方法】利用Illumina HiSeq高通量测序平台对KJ40菌株进行全基因组测序,使用相关软件对测序数据进行基因组组装、基因预测和功能注释、预测次级代谢产物合成基因簇、共线性分析等。【结果】基因组最后得到9个Scaffolds和578个Contigs,总长度为7 261 502 bp,G+C%含量平均为73.41%,预测到6 605个基因、1 260个串联重复序列、804个小卫星序列、67个微卫星序列、90个tRNA、9个rRNA和19个sRNA。其中,2 429、3 765、2 890、6 063和1 911个基因分别能够在COG、GO、KEGG、NR和Swiss-Prot数据库提取到注释信息。同时,还预测得到21个次级代谢产物合成基因簇。基因组测序数据提交至NCBI获得Gen Bank登录号:LORI00000000。S.sampsonii KJ40与Streptomyces coelicolor A3(2)、Streptomyces griseus subsp.griseus NBRC 13350三株链霉菌基因组存在翻转、易位等基因组重排,3个基因组共有1 711个蛋白聚类簇。【结论】研究为从基因组层面上解析KJ40菌株具有良好促生防病效果的内在原因提供基础数据,为深入了解链霉菌次级代谢合成途径提供参考信息,对S.sampsonii后续相关研究具有重要意义。     

柑橘青霉菌CYP51B基因和上游调控区克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柑橘青霉菌(意大利青霉菌,Penicillium italicum)CYP51的同源基因,并对基因序列进行生物信息学分析。【方法】通过PCR及染色体步移技术得到基因的完整序列及上下游调控序列。通过生物信息学手段对基因的结构进行分析:使用NNPP分析软件预测转录起始位点,并利用TFSEARCH1.3软件分析转录因子结合位点。利用SWISS-MODEL在线软件对蛋白进行同源模建。【结果】克隆得到了意大利青霉菌CYP51的同源基因,命名为Pi CYP51B。获得的Pi CYP51B及上下游调控区序列总长为3 496 bp,包括上游910 bp和下游834 bp的序列。Pi CYP51B基因的开放阅读框全长1 575 bp,编码524个氨基酸。该基因含有3个分别为74、51、52 bp的内含子,分别位于247 bp与320 bp之间,519 bp与569 bp之间,1 635 bp与1 686 bp之间。Pi CYP51B 5′上游调控区序列的总长为579 bp。生物信息学分析结果显示:转录起始位点位于上游458 bp处;上游调控区不仅包含启动子的核心结构序列TATA盒(位于-25 bp处),也包含多个转录因子结合位点,如Abd-B、ADR1、AP-4、GATA-1、Cdx A、Clox和Oct-1等。在上游调控序列中嘌呤含量高,而且从+387 bp处开始存在4个连续高嘌呤含量的热激转录因子特异性结合位点(HSF);在+106 bp处开始存在3个连续的Cdx A转录因子结合位点。选用人CYP51晶体结构(PDB ID:3LD6)为模板,利用SWISS-MODEL在线软件构建了意大利青霉菌CYP51B蛋白的结构模型。【结论】克隆了意大利青霉Pi CYP51B基因,其上游含有多个热激应答转录因子特异性结合位点(HSF)表明其参与逆境应答。该基因作为意大利青霉菌CYP51的同源基因,可能与青霉菌对真菌药物的抗药性密切相关。     

链霉菌基因组中放线菌型整合性接合元件的识别

【目的】链霉菌染色体重组和外源DNA片段插入是影响其遗传多样性的主要因素。旨在考察放线菌型整合性接合元件(AICE)在链霉菌遗传多样性中所发挥的作用。【方法】基于AICE的特征性模块, 采用隐马尔科夫模型预测链霉菌基因组序列中的AICEs。【结果】在已全测序的12条链霉菌染色体和35个质粒中, 共识别出29个AICEs, 其中12个为首次报道。Streptomyces coelicolor基因组中发现了4个AICEs, 而其近缘的Streptomyces lividans却没有。【结论】AICEs都整合在链霉菌染色体的核心区, 且都具有典型的整合环出、复制和接合转移等核心模块, 这些可自行转移的元件在链霉菌基因组可塑性中扮演了重要角色。     

链霉菌小质粒pDYM4.3k的复制与接合转移

【目的】链霉菌(Streptomyces)X335是从西藏高原活拉山口分离到的,其中含有一个大小为4.3 kb的环型质粒pDYM4.3k。克隆、测序和分析pDYM4.3k,以及鉴定复制和接合转移的基因。【方法】通过克隆和引物延伸获得pDYM4.3k的全序列,利用比对分析推测基因的功能,通过Southern杂交检测复制中间体,利用平板杂交实验证明接合转移功能。【结果】克隆和测序获得了全长为4346 bp的pDYM4.3k序列,预测仅有3个基因,其中1个基因与链霉菌主要接合转移基因同源,另外2个为功能未知。鉴定新的基因orf1及其上游的约300 bp构成了质粒的基本复制区域。检测到质粒存在单链的复制中间体,表明它以滚环方式进行复制。实验证明pDYM4.3k在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中具有接合转移功能。【结论】质粒pDYM4.3k可以滚环方式进行复制和在链霉菌之间进行接合转移。这是目前报道的最小的、具有游离复制和接合转移功能的链霉菌质粒。     

5-氟尿嘧啶与氯化锂对高产量快中子诱变株龟裂链霉菌1626的诱变作用

在快中子及其与氯化锂复合处理龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的工作中,选得高产量快中子诱变株S.rimosus 1626。为了进一步提高快中子诱变株的抗菌素产量,比较了5-氟尿嘧啶与氯化锂对高产量快中子诱变株S.rimosus 1626的诱变作用。     

基因组信息指导的星海链霉菌中2-甲硫基-N6-(4-羟基异戊烯基)-腺苷的分离鉴定

【目的】研究海洋链霉菌新种星海链霉菌Streptomyces xinghaiensis NRRL B24674~T次级代谢物中是否存在2-甲硫基-N~6-异戊烯基修饰的腺苷。【方法】通过生物信息学分析星海链霉菌S.xinghaiensis NRRL B24674~T基因组序列,寻找这类化合物的生物合成相关基因;采用正相硅胶柱色谱、反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和高效液相色谱等分离技术对该菌株的发酵粗提物进行分离纯化;利用质谱与核磁共振等波谱技术鉴定化合物的结构。【结果】在星海链霉菌基因组中找到含有2-甲硫基-N~6-异戊烯基修饰的化合物生物合成途径中的2个同源蛋白;从该菌的发酵液中分离鉴定了2-甲硫基-N~6-(4-羟基异戊烯基)-腺苷(ms2io6A)。【结论】星海链霉菌S.xinghaiensis NRRL B24674~T存在此类腺苷修饰反应,并且是首次在链霉菌中发现此类腺苷修饰。生物信息学分析预示着链霉菌中可能普遍存在此类核酸或者核苷修饰。     

枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex对乙偶姻合成的影响

【背景】枯草芽孢杆菌体内含有一种可响应胞内氧化还原水平的因子,称之为氧化还原感应全局调控因子Rex (由基因ydiH编码)。Rex可通过感知辅酶NADH/NAD+水平的变化来调节胞内氧化还原平衡。【目的】研究Rex对枯草芽孢杆菌乙偶姻合成和辅因子代谢的相关性。【方法】利用比较转录组挖掘乙偶姻和2,3-丁二醇可逆转化过程中显著差异的基因,并通过Cre/lox基因敲除技术敲除ydiH、acuA (乙酰AcsA)和acoC (二氢脂酰胺乙酰转移酶)。随后,利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析敲除菌株中乙偶姻相关基因的转录水平。【结果】通过发酵实验发现,敲除ydiH会在一定程度上抑制菌体的生长速率,但发酵前期乙偶姻单位细胞产量和底物转化率都得到了显著提高;敲除acuA和acoC后,对乙偶姻合成、菌体生长和糖耗速率均影响不大;敲除ydiH后,与乙偶姻合成相关基因alsR (alsSD的正转录调控因子)、alsS (α-乙酰乳酸合成酶)、alsD (α-乙酰乳酸脱羧酶)和bdhA (2,3-丁二醇脱氢酶)的转录水平显著上调。【结论】枯草芽孢杆菌氧化还原感应全局调控因子Rex通过抑制与乙偶姻相关基因的转录水平影响乙偶姻合成。本研究首次报道了枯草芽孢杆菌中Rex和乙偶姻合成的相关性,为探索Rex如何通过调控相关基因的转录来影响胞内氧化还原稳态奠定了基础,也为提高枯草芽孢杆菌工业化生产强度和底物转化率提供了借鉴。     

两株海洋放线菌的产色素特性

【背景】生物产生的天然色素在工业、农业和纺织工业上有潜在应用价值。【目的】通过对产色素海洋放线菌的分离与筛选,为开发细菌所产生的天然色素在纺织与食品工业中的应用奠定基础。【方法】筛选胞外产可溶性色素的放线菌,并通过16S rRNA基因序列测定和分析构建其系统发育树,并对影响色素产量的因素和色素稳定性进行实验。【结果】获得了一株产蓝色色素的放线菌Q2N-42和一株产黄绿色色素的放线菌X4C-5,16S rRNA基因序列分析表明它们分别与天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)或紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)和普拉滕斯链霉菌(Streptomyces pratensis)的16S rRNA基因序列存在较高的相似性。通过研究不同碳源和氮源对放线菌Q2N-42和X4C-5产色素的影响,发现甘油和硝酸钠能明显地增加天蓝色链霉菌(S. coelicolor) Q2N-42的色素产量,而淀粉和硝酸钠能明显地增加普拉滕斯链霉菌(S. pratensis) X4C-5的色素产量。这两种色素对不同浓度的氧化剂、还原剂、盐和pH都表现出良好的稳定性;色素的红外光谱测定表明,其结构分别包含了?OH、?CH3和C=C基团。通过色素和不同媒染剂对棉线染色,发现硫酸铜是蓝色色素良好的媒染剂,毛线着色较深,洗涤不易脱色;而硫酸亚铁是绿色色素良好的媒染剂,毛线着色较深、有光泽,洗涤不易脱色。【结论】放线菌株Q2N-42和X4C-5所产生的色素为其工业应用提供了潜在的天然色素资源。     

工程改造龟裂链霉菌提高土霉素产量

土霉素是由龟裂链霉菌合成的一类广谱性抗生素,前期研究工作证明其生物合成受其自身途径特异性调控蛋白OtcR的直接调节,OtcR能够激活和促进土霉素合成基因簇的转录表达。在龟裂链霉菌M4018宿主内利用强启动子单独过表达OtcR蛋白,使土霉素的产量提高到原来产量的4倍;为了进一步提高土霉素产量,在M4108宿主内表达乙酰辅酶A羧化酶基因,提高其胞内土霉素合成的前体物丙二酸单酰辅酶A的含量。对出发菌株M4018进行工程改造,同时过表达途径特异性调控蛋白OtcR和乙酰辅酶A羧化酶,发酵检测改造后的重组工程菌株土霉素的产量由1.37g/L提高到9.09g/L,该研究策略对工程改造龟裂链霉菌提高土霉素的产量具有重要的指导意义。     

龟裂链霉菌zwf2基因阻断提高土霉素生物合成

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是链霉菌磷酸戊糖途径中第一个酶("看家"酶),也是形成NADPH的关键酶,由zwf1和zwf2基因编码.以温敏型质粒pKC1139为基础构建了用于阻断龟裂链霉菌zwf2的重组质粒pKC1139-zwf2',通过大肠杆菌GM2929去甲基化pKC1139-zwf2'后电转至原始龟裂链霉菌M4018感受态细胞,筛选得到转化子.转化子进一步通过PCR鉴定和点杂交印迹分析鉴定,证明是zwf2基因阻断的阳性突变子命名为M4018-△zwf2.以原始菌株为对照,突变子摇瓶发酵结果表明:突变子的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活是原始菌的50%左右,但土霉素生物合成水平则提高了27%;在细胞生长方面,二者均在第4d进入生长稳定期而开始大量合成土霉素,发酵结束时细胞菌体浓度基本相同,但突变子的单位菌丝体土霉素生物合成能力则提高了31%.因此,zwf2的阻断有利于土霉素的生物合成,而对细胞生长没有明显影响.     

适合龟裂链霉菌~(13)C代谢通量分析合成培养基的优化及应用

为开发一种适合龟裂链霉菌13C代谢通量分析的合成培养基,以龟裂链霉菌模式菌株M4018为研究对象,比较其在各种有机氮源和无机氮源的生长和土霉素合成特性。首次筛选到以硝酸钾为主要氮源的合成培养基,通过响应面分析法进一步优化,将土霉素合成能力由75.2 mg/L提高到145.6 mg/L。并应用到100%的1-13C葡萄糖标记实验,首次从同位素标记代谢流分析上证实了龟裂链霉菌中不存在2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径(Entner-Doudoroff pathway,ED),为龟裂链霉菌13C代谢通量分析提供了重要基础。     

A novel streptomycete lipase: cloning,sequencing and high-level expression of the Streptomyces rimosus GDS(L)-lipase gene

An extracellular lipase from Streptomyces rimosus R6-554W has been recently purified and biochemically characterized. In this report the cloning, sequencing, and high-level expression of its gene is described. The cloned DNA contained an ORF of 804 bp encoding a 268-amino-acid polypeptide with 34 amino acid residues at the amino terminus of the sequence that were not found in the mature protein. The theoretical molecular mass (24.172 kDa) deduced from the amino acid sequence of the mature enzyme was experimentally confirmed. This lipase showed no overall amino acid sequence similarity to other lipases in the databases. However, two hypothetical proteins, i. e. putative hydrolases, derived from the genome sequencing data of Streptomyces coelicolor A3(2), showed 66% and 33% identity. In addition, a significant similarity to esterases from Streptomyces diastatochromogenes and Aspergillus terreus was found. Sequence analysis revealed that our novel S. rimosus lipase containing a GDS(L)-like consensus motif belongs to family II of lipolytic enzymes, previously unrecognized in Streptomyces. When the lipase gene was expressed in a S. rimosus lipase-deficient strain harboring the lipase gene on a high-copy-number vector, lipase activity was 22-fold higher than in the original strain.     

Cloning, expression in Escherichia coli and nucleotide sequence of a tetracycline-resistance gene from Streptomyces rimosus

Determinants of tetracycline resistance have been cloned from two different tetracycline-producing industrial strains of Streptomyces into Streptomyces lividans using the plasmid vector pUT206. Three plasmids, pUT250 and pUT260 with a 9.5 and a 7.5 kb insert respectively of Streptomyces rimosus DNA, and pUT270 with a 14.0 kb insert of Streptomyces aureofaciens DNA, conferring resistance to tetracycline, have been isolated. By in vitro sub-cloning, a similar fragment of 2.45 kb containing the tetracycline resistance gene (tet347) was further localized on these plasmids. The S. rimosus gene has been cloned into Escherichia coli and expressed under the control of lambda pL or Lpp promoters. Differential protein extraction of E. coli cells revealed the presence of an additional membrane-embedded protein in tetracycline-resistant cells. On the basis of available restriction endonuclease maps, the tet347 gene is probably identical to the tetB gene from S. rimosus recently identified by T. Ohnuki and co-workers as responsible for the reduced accumulation of tetracycline. The nucleotide sequence of a 2052 bp DNA fragment containing the TcR structural gene from S. rimosus has been determined. The amino acid sequence of the tet347 protein (Mr35818) deduced from the nucleotide sequence shows a limited but significant homology to other characterized tetracycline transport acting determinants from pathogenic bacteria.     

Molecular cloning and functional characterization of an ATP-binding cassette transporter OtrC from Streptomyces rimosus

ABSTRACT: BACKGROUND: The otrC gene of Streptomyces rimosus was previously annotated as an oxytetracycline (OTC) resistance protein. However, the amino acid sequence analysis of OtrC shows that it is a putative ATP-binding cassette (ABC) transporter with multidrug resistance function. To our knowledge, none of the ABC transporters in S. rimosus have yet been characterized. In this study, we aimed to characterize the multidrug exporter function of OtrC and evaluate its relevancy to OTC production. RESULTS: In order to investigate OtrC's function, otrC is cloned and expressed in E. coli The exporter function of OtrC was identified by ATPase activity determination and ethidium bromide efflux assays. Also, the susceptibilities of OtrC-overexpressing cells to several structurally unrelated drugs were compared with those of OtrC-non-expressing cells by minimal inhibitory concentration (MIC) assays, indicating that OtrC functions as a drug exporter with a broad range of drug specificities. The OTC production was enhanced by 1.6-fold in M4018 (P = 0.000877) and 1.4-fold in SR16 (P = 0.00973) duplication mutants, while it decreased to 80% in disruption mutants (P = 0.0182 and 0.0124 in M4018 and SR16, respectively). CONCLUSIONS: The results suggest that OtrC is an ABC transporter with multidrug resistance function, and plays an important role in self-protection by drug efflux mechanisms. This is the first report of such a protein in S. rimosus, and otrC could be a valuable target for genetic manipulation to improve the production of industrial antibiotics.