6个山黧豆品种的β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性及其关系分析北大核心CSCD

山黧豆(Lathyrus spp.)种质资源评价与筛选长期聚焦于获得低β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionicacid,β-ODAP)含量或低蛋白酶抑制剂活性的品种。为了研究β-ODAP含量与蛋白酶抑制剂活性之间的潜在关系,该研究利用SDS-PAGE、酶活检测和相关性分析等方法对家山黧豆(L.sativus)、扁荚山黧豆(L.cicera)等6个山黧豆品种的蛋白酶抑制剂活性、β-ODAP含量及二者之间的关系进行了分析。结果表明:(1)不同山黧豆品种的醇溶蛋白和可溶蛋白电泳图谱呈现出显著的差异。(2)不同山黧豆种子的胰蛋白酶抑制剂活性介于100~190 TIU之间,胰凝乳蛋白酶抑制剂活性介于5~9 CIU之间。(3)β-ODAP含量与丝氨酸乙酰基转移酶活性的皮尔逊相关系数可达0.76,呈显著正相关关系。(4)山黧豆转录组数据(SRP145030)中的β-ODAP生物合成关键基因与Bowman-Birk蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk inhibitor, BBi)基因表达水平呈显著负相关关系。该研究结果为进一步探讨分析山黧豆β-ODAP和BBi生物合成的调控与平衡,改善山黧豆的含硫氨基酸水平等奠定了基础。     

山黧豆β 腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表达及蛋白聚合状态分析

该研究从山黧豆种子萌发6 d后的幼苗根中扩增到β 腈基丙氨酸合成酶基因(LsCAS)的CDS序列,并构建pGEX2T LsCAS表达载体;经诱导表达后,通过GST亲和层析进行LsCAS蛋白纯化,并利用GST标签抗体和大豆半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase,CS)抗体对纯化蛋白进行Western blot验证;纯化后的LsCAS蛋白经凝血酶切除GST标签抗体后,利用凝胶过滤预装柱Superdex 200 Increase 10/300 GL分析判断分子量。结果显示：(1)山黧豆LsCAS基因的CDS序列为1 035 bp,编码344个氨基酸;其编码的蛋白质具有典型的CBS like 蛋白功能结构域胱硫醚β 合酶(CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)。(2)成功构建LsCAS基因的原核表达载体pGEX2T LsCAS并进行蛋白纯化;SDS PAGE检测表明,所获融合蛋白条带单一,大小在64 kD左右;Western blot分析发现,诱导后的菌体蛋白和纯化后的重组蛋白中均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为山黧豆LsCAS蛋白。(3)纯化的山黧豆LsCAS蛋白在412 nm的特征吸收峰显示,LsCAS隶属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖的半胱氨酸合成酶家族;分子排阻试验证实山黧豆LsCAS为PLP依赖性蛋白酶,可能以四聚体方式发挥作用。研究结果为进一步探讨山黧豆LsCAS的调控及其功能奠定了基础。     

山黧豆活性成分β-ODAP的检测方法研究进展北大核心CSCD

β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)是山黧豆中的一种重要非蛋白氨基酸,与三七中的三七素为同一种次生代谢物,具有止血、兴奋神经、抗菌等多种生物活性。自20世纪60年代和80年代在山黧豆等豆类和三七等植物中分别发现β-ODAP以来,科研工作者建立了多种检测方法。该文对近年来国内外有关检测β-ODAP的传统分析法、高效液相色谱法(HPLC)、色谱-质谱法(GC/LC-MS)、毛细管电泳法及酶学分析法等的基本原理及应用研究进展进行了综述,这些检测方法各有所长,具体选择依实验条件和实验目的而定。其中,柱前衍生化高效液相色谱法是目前应用最广泛的方法,高成本同位素内标的LC-MS则被誉为“金标准”。但特异、快速和低成本的检测方法一直是人们的追求目标,因而进一步完善酶传感器技术是β-ODAP检测领域在将来的主要研究方向。     

山黧豆毒素β-ODAP的生态学功能及应用

山黧豆是一种具有广谱抗逆性且营养丰富的豆科作物,但其含有β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙氨酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid, β-ODAP)神经毒素,人畜长期大量食用会导致神经性中毒,因此限制了山黧豆种质资源的利用.本文综述了干旱胁迫下山黧豆毒素β-ODAP对植株渗透调节和生长调节的影响,以及β-ODAP的分析方法、毒理机理和实用价值方面的研究进展,并对低毒和无毒品种选育策略进行了总结.干旱胁迫下,山黧豆合成大量毒素β-ODAP,其含量随胁迫程度增强而逐渐升高.β-ODAP可为植株生长和种子发育提供氮源,并积极参与清除活性氧过程,作为小分子可溶性氨基酸参与渗透调节,作为锌离子转运体参与根瘤发育.而含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)含量升高可使山黧豆毒性显著降低.近年来,在山黧豆种质资源收集、杂交育种,以及通过组织培养和基因操作等技术进行低毒或无毒山黧豆品种选育方面做了大量工作.β-ODAP可通过破坏细胞内Ca²⁺稳态和作为谷氨酸类似物引发兴奋性中毒,但在止血和抗肿瘤等方面有重要的药用价值.     

热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性

【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂,用体外酶学实验对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列,通过BLAST程序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了异源表达,并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验进行表征,而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性,可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30°C,最适p H为7.0。70°C保温8 h后仍有45%的活性残留,表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C.owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂,可以用于聚酮前体的合成。     

水分胁迫对山黧豆萌发过程中β—ODAP和氨基酸的影响

山黧豆（Lathyrus sativus)种子在萌发过程中,根芽中β-N-草酰基-L-2,3-二氨基丙酸（β-ODAP）6d前逐渐增加,尔后不断下降;在水分胁迫条件下,β-ODAP和游离氨基酸含量随水分胁迫的增加而上升,子叶中β-ODAP在3d前高于根芽,然后下降并低于根芽,子叶中β-ODAP含量随着胁迫的增加而降低。     

决明查尔酮合成酶的同源模建和分子模拟对接

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物中类黄酮生物合成途径的关键酶,其催化对-香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A发生缩合反应.本研究以苜蓿CHS的晶体为模板,利用同源建模构建决明CHS的三维模型.经过动力学优化后,决明CHS的三维模型与苜蓿CHS的结构极为相似,主要由α-螺旋和β-折叠构成,其中有13个α螺旋,占32.82％,15个β折叠,占19.23％,无规则卷曲占47.95％.模型验证结果表明决明CHS的三维模型具有合理的立体化学性质与氨基酸相容性.决明CHS含有两个重要的结构域:对-香豆酰辅酶A结合域与丙二酸单酰辅酶A结合域.决明CHS与对-香豆酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A的结合主要通过氢键与范德华力.决明CHS中Cys164、His303与活性中心的H2O能够形成电子传递体系,参与对-香豆酰辅酶A形成CHS-对-香豆酰基中间产物.本研究结果为利用此类CHS三维模型研究其催化机理和分子工程改造奠定基础.     

山黧豆神经性中毒机理的研究进展

山黧豆(Lathyrus sativas L.)是优良的旱地作物种质资源,但长期过量食用会导致人畜神经性山黧豆中毒(neurolathyrism)。山黧豆中毒是一种发生在人类和动物中的神经退行性疾病,在发展中国家(如印度、孟加拉国、巴基斯坦、尼泊尔、埃塞俄比亚和我国西北等地区)时有发生,但其细胞及分子机理尚不明确。研究山黧豆中毒的致病机理对防止山黧豆中毒和中毒后的有效治疗具有重要意义。已有的研究表明,β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid,β-ODAP)为主要致病毒素,其可通过干扰谷氨酸的正常功能、破坏神经细胞内钙稳态、加剧氧化胁迫并破坏线粒体的功能等来诱发神经细胞损伤或死亡,阻断交感神经对肌肉的控制,最终导致人下肢或动物后肢肌肉萎缩和不可逆瘫痪。文章综述了近年来神经性山黧豆中毒的机制研究,对今后的研究提供参考和借鉴。     

山黧豆属作物在土耳其的栽培与利用状况北大核心CSCD

众所周知,山黧豆起源于巴尔干半岛并传播到世界各地。在土耳其,山黧豆属作物有73个分类群(约1/3为地方特有种),在全国各地均有分布种植,但主要集中在黑海中部、东南部和安纳托利亚东部地区。该文介绍了山黧豆属作物在土耳其全国的分布和在局部地区的食用、观赏等资源利用和保存情况。通常,不同国家人民会因为文化差异形成不同的饮食习惯,但山黧豆大多被用于制作汤、面包或其他咸点。山黧豆的栽培技术则因地制宜,土耳其在边缘土地上进行旱作种植,中国和印度部分地区多采用轮作种植方法等。作为一种极“小众”的作物,山黧豆研究工作的从业人员极少,而且缺乏大型联合研究项目。因此,需要联合化学、表型和分子分析等方法,以保护世界各地包括土耳其在内的地方种质资源,尤其是培育适合土耳其、中国等世界各国的食饲兼用型低β-ODAP品种。总之,选育低β-ODAP或不含β-ODAP的山黧豆品种将有助于丰富人类在食用、饲用和观赏等方面的物种资源利用。     

聚苹果酸聚合途径中苹果酰辅酶A连接酶基因的克隆、表达及酶学性质

【目的】研究出芽短梗霉聚苹果酸聚合途径中苹果酰辅酶A连接酶基因及其酶学特性。【方法】通过设计兼并引物,采用IPCR技术从出芽短梗霉CCTCC M2012223的基因组中扩增得到苹果酰辅酶A连接酶基因的cDNA全长序列,构建表达载体,通过大肠杆菌异源表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】获得苹果酰辅酶A连接酶基因序列全长为1498 bp,编码440 aa,含有4个外显子和3个内含子。该重组酶最适反应温度为25℃,最适反应pH值为8.0,高浓度底物ATP明显对酶活性具有抑制作用,单体选择性表明对底物草酸、草酰乙酸、丁酸、丙二酸也具有很好催化活性。【结论】成功从出芽短梗霉CCTCC M2012223中克隆获得聚苹果酸聚合途径的苹果酰辅酶A连接酶基因,为聚苹果酸聚合途径解析及新型可降解材料创制奠定基础。     

The AAE14 gene encodes the Arabidopsis o-succinylbenzoyl-CoA ligase that is essential for phylloquinone synthesis and photosystem-I function

Phylloquinone is the one-electron carrier at the A₁ site of photosystem I, and is essential for photosynthesis. Arabidopsis mutants deficient in early steps of phylloquinone synthesis do not become autotrophic and are seedling lethals, even when grown on sucrose-supplemented media. Here, we identify acyl-activating enzyme 14 (AAE14, At1g30520) as the o -succinylbenzoyl-coenzyme A (OSB-CoA) ligase acting in phylloquinone synthesis. Three aae14 mutant alleles, identified by reverse genetics, were found to be seedling lethal, to contain no detectable phylloquinone (< 0.1 pmol mg⁻¹ fresh weight) compared with 10 pmol mg⁻¹ fresh weight in wild-type leaves, and to accumulate OSB. AAE14 was able to restore menaquinone biosynthesis when expressed in an Escherichia coli mutant disrupted in the menE gene that encodes the bacterial OSB-CoA ligase. Weak expression of an AAE14 transgene in mutant plants (controlled by the uninduced XVE promoter) resulted in chlorotic, slow-growing plants that accumulated an average of 4.7 pmol mg⁻¹ fresh weight of phylloquinone. Inducing the XVE promoter in these plants, or expressing an AAE14 transgene under the control of the CaMV 35S promoter, led to full complementation of the mutant phenotype. aae14 -mutant plants were also able to synthesize phylloquinone when provided with 1,4-dihydroxy-2-naphthoate, an intermediate in phylloquinone synthesis downstream of the OSB-CoA ligase reaction. Expression of an AAE14:GFP reporter construct indicated that the protein accumulated in discrete foci within the chloroplasts. This and other evidence suggests that the enzymes of phylloquinone synthesis from isochorismate may form a complex in the chloroplast stroma to facilitate the efficient channeling of intermediates through the pathway.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.