山黧豆β 腈基丙氨酸合成酶基因LsCAS的原核表达及蛋白聚合状态分析

该研究从山黧豆种子萌发6 d后的幼苗根中扩增到β 腈基丙氨酸合成酶基因(LsCAS)的CDS序列，并构建pGEX2T LsCAS表达载体；经诱导表达后，通过GST亲和层析进行LsCAS蛋白纯化，并利用GST标签抗体和大豆半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase，CS)抗体对纯化蛋白进行Western blot验证；纯化后的LsCAS蛋白经凝血酶切除GST标签抗体后，利用凝胶过滤预装柱Superdex 200 Increase 10/300 GL分析判断分子量。结果显示：(1)山黧豆LsCAS基因的CDS序列为1 035 bp，编码344个氨基酸；其编码的蛋白质具有典型的CBS like 蛋白功能结构域胱硫醚β 合酶(CBS)和半胱氨酸合成酶(CS)。(2)成功构建LsCAS基因的原核表达载体pGEX2T LsCAS并进行蛋白纯化；SDS PAGE检测表明，所获融合蛋白条带单一，大小在64 kD左右；Western blot分析发现，诱导后的菌体蛋白和纯化后的重组蛋白中均能检测到特征条带，说明所获融合蛋白为山黧豆LsCAS蛋白。(3)纯化的山黧豆LsCAS蛋白在412 nm的特征吸收峰显示，LsCAS隶属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖的半胱氨酸合成酶家族；分子排阻试验证实山黧豆LsCAS为PLP依赖性蛋白酶，可能以四聚体方式发挥作用。研究结果为进一步探讨山黧豆LsCAS的调控及其功能奠定了基础。