miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。     

RORα高表达抑制人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路靶基因表达

该文探讨了RORα(retinoid acid receptor related orphan receptorα)高表达对人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路靶基因的作用。采用MTT检测了MGC803细胞增殖。采用RT-PCR、Western blot与免疫共沉淀检测了Wnt/β-catenin信号通路相关分子与靶基因表达。荧光素酶报告基因方法检测c-Myc基因启动子活性。MTT结果显示,RORα高表达人胃癌MGC803细胞的增殖能力较对照组明显减弱(P0.05)。RT-PCR与Western blot结果显示,RORα高表达组Wnt1m RNA与蛋白质水平较对照组下调(P0.05),而β-catenin m RNA与蛋白质水平无差异(P0.05)。免疫共沉淀结果显示,RORα高表达组RORα与β-catenin结合明显增加(P0.05)。RORα高表达可显著下调核内β-catenin水平(P0.05),同时可显著下调TCF-4(T cell factor-4)蛋白质水平(P0.05)。RORα高表达可显著下调Axin、c-Myc、c-Jun m RNA与蛋白质水平(P0.05)。荧光素酶报告基因实验结果显示,RORα高表达c-Myc启动子活性明显降低(P0.05)。以上结果表明,RORα高表达可通过调控Wnt/β-catenin信号通路相关分子基因表达来抑制人胃癌细胞增殖。     

甲状腺乳头状癌中TLR4对Foxp3表达的调控作用分析

目的:探讨人甲状腺乳头状癌(PTC)细胞中TLR4信号通路对Foxp3表达的调控作用。方法:以人甲状腺乳头状癌K1细胞株为实验材料,选用脂多糖(LPS)作为配体来激活TLR4信号通路,采用RT-PCR方法检测LPS在不同浓度(0,5,10,20,40μg/mL)和不同时间点(12,24,36,48 h)Foxp3的mRNA表达量,流式细胞术检测相应浓度和时间点的Foxp3蛋白和TLR4蛋白表达量的变化;加入LPS抑制剂多粘菌素B(PMB)后Foxp3和mRNA和蛋白的表达量分别利用RT-PCR和流式细胞术检测。结果:10μg/mL的LPS可以显著上调PTC细胞中Foxp3 mRNA和蛋白的表达量(P0.05),在第24小时达到最佳;LPS作用下,TLR4表达量上调;PMB阻断TLR4信号通路后,Foxp3蛋白表达量较未阻断组显著降低(P0.05)。结论:在甲状腺乳头状癌K1细胞株中,TLR4作为上游信号调控因子,通过自身表达量改变,进而参与调控Foxp3的表达。     

HBeAg对健康人单核细胞来源树突状细胞表面TLR2和PD-L1表达水平的影响

目的:观察乙型肝炎e抗原(HBeAg)对健康人单核细胞来源的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表面Toll样受体2(TLR 2)和程序性死亡配体-1(PD-L1)表达的影响,进一步探讨乙肝病毒感染慢性化过程中HBeAg的作用机制.方法:利用Ficoll分离法分离健康人外周血单个核细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养树突状细胞,将第7天的细胞分成三组,分别为HBeAg刺激组、OVA无关蛋白对照组和未刺激组,经流式细胞仪检测CD11c+细胞袁面TLR2以及PD-L1的表达水平.结果:健康人单核细胞来源的树突状细胞经过HBeAg刺激9h后,CD1 1c+细胞表面TLR 2的表达水平较未刺激组以及OVA无关蛋白对照组明显下降(P＜0.01),同时可见CD11c+细胞表面PD-L1表达水平显著增加(P＜0.01).结论:HBeAg可以下调DCs表面TLR2受体的表达,并上调其表面负性调节因子PD-L1的表达.HBV可通过HBeAg作用于抗原递呈细胞相关表面受体,从而影响了其正常功能,并最终影响免疫系统对病毒的清除作用,导致乙肝病毒感染的慢性化.     

基于分子对接的合欢皂苷J_(8)抑制血管内皮细胞增殖作用靶点及其凋亡相关细胞信号通路研究CSCD

为探讨合欢皂苷J_(8)(julibroside J_(8),J8)抑制肿瘤血管内皮细胞增殖作用靶点及其相关细胞凋亡的信号通路。本文采用HPLC法检测内皮细胞经J8作用后,J8的在细胞内外含量变化;Vina软件将J8与VEGF、FAS、DR3、DR4、DR5、TFR-1进行分子对接分析;Western blot法检测在加药前后,内皮细胞中VEGF、p-JNK、Bax、EnDOG、Caspase-3、Caspase-8以及Caspase-9蛋白表达水平的变化。分子对接结果表明VEGF、FAS对应的靶点蛋白与J8结合性能较好且多位点结合。HUVEC细胞在加入J8作用24 h后,VEGF、p-JNK等蛋白表达明显下调,并可显著上调诱导凋亡相关蛋白Bax和EnDOG的表达,而且对Caspase-3、Caspase-8以及Caspase-9的表达水平无显著的影响。J8可能是通过与血管内皮细胞膜表面的VEGF结合,抑制血管内皮细胞增殖,通过削弱VEGF/JNK通路活性从而引起内皮细胞凋亡。     

尼罗罗非鱼traf6基因表达谱及信号转导

肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)是一种重要的接头蛋白,在Toll样受体/白细胞介素-1受体(TLR/IL-1R)超家族所触发的信号通路中起重要作用,与先天性免疫密切相关。文章研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)traf6的表达模式和初步的功能。在健康鱼中,traf6转录本广泛表达于所有受检组织中,在血液中表达水平最高,在肝脏中最低。在不同的胚胎发育阶段也检测到traf6的表达。在无乳链球菌体内感染后,大多数受检组织中traf6 mRNA的表达量上调。此外,LPS、Poly I:C和S.agalactiae可显著诱导尼罗罗非鱼巨噬细胞traf6的表达。此外,在HEK293T细胞中过表达表明,TRAF6分布于细胞质中,可显著提高NF-κB的活性。免疫共沉淀(Co-IP)实验表明,TRAF6可与IRAK1(白细胞介素-1受体相关激酶1)相互作用,IRAK1在TLR/IL-1R信号通路中也起重要作用。在体内,TLR2、TLR21和TLR13b的过表达可上调traf6 mRNA的表达水平,表明TRAF6参与了TLR2、TLR21和TLR13b介导的信号转导,提示TRAF6在病原体入侵的免疫应答中起重要作用。     

肺炎支原体Msr B经MAPK/NF-κB通路抑制脂质相关膜蛋白诱生促炎细胞因子

蛋氨酸亚砜还原酶B(methionine sulfoxide reductase, MsrB)是一种重要的氧化还原蛋白。该文探究了肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp) MsrB对Mp脂质相关膜蛋白(lipidassociated membrane proteins, LAMPs)刺激的人髓系白血病单核细胞(THP-1细胞)分泌促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)的调节及相关信号通路,以进一步了解Mp的免疫逃避机制。论文构建了pET28a(+)-msr B重组质粒,诱导表达、鉴定、纯化重组蛋白(rMsrB)并制备了多克隆抗体; Western blot检测MsrB、TLR1、TLR2、TLR6和MyD88蛋白表达水平及NF-κB p65、P38、ERK和JNK的总蛋白和磷酸化蛋白水平;间接免疫荧光分析NF-κB核转位; ELISA测定TNF-α和IL-1β分泌水平。结果显示Msr B可表达于Mp胞质和胞膜。rMsrB预处理可抑制LAMPs刺激的THP-1细胞合成TNF-α和IL-1β。Mp rMsrB可抑制LAMPs刺激的TH...     

宿主-病毒在RIG-I信号通路中的相互作用

维甲酸诱导基因-I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)已经被鉴定为RNA病毒感染的细胞传感元件,它与线粒体衔接蛋白MAVS/IPS-1/VISA/Cardif相互作用,诱导I型干扰素(interferon,IFN)介导的宿主抗病毒感染天然免疫.然而,许多病毒已经进化出了种种策略破坏RIG-I介导的信号通路.宿主-病毒的这种相互作用为揭示病毒感染的致病机理和发现开发抗病毒药物的靶标提供了机遇.本文主要综述RIG-I信号通路及不同病毒用来逃避RIG-I信号的策略.     

肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs的表达及细胞凋亡的影响

在肺癌等的癌细胞中,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等致炎因子介导的促瘤效应涉及Toll样受体(Toll like receptors, TLRs)/纤维型肌动蛋白(fibrous actin, F-actin)通路。该研究探讨了外源性松胞菌素D(cytochalasin D, cytD)和细胞内源过表达的重组肌动蛋白解聚因子丝切蛋白(Cofilin-1)所诱导的肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLR2、TLR4和TLR9的表达和细胞凋亡水平的影响。分别用6种不同浓度的cytD处理RAW264.7小鼠巨噬细胞48 h,用Western blot检测6组细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达水平。构建重组pEGFP-N1-Cofilin-1质粒并转染RAW264.7细胞,设置空质粒对照和空白细胞对照组。用Real-time PCR法和Western blot检测细胞转染前后Cofilin-1表达水平;Western blot检测巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达情况;用流式细胞术检测3组细胞的凋亡水平。结果显示,终浓度≥1.5μmol/L的cytD处理细胞后, RAW264.7细胞表达TLR2明显降低(P0.05);终浓度≥1.0μmol/L的cytD处理细胞后,巨噬细胞表达TLR4、TLR9明显降低(P0.05)。重组质粒转染组细胞的cofilin-1 mRNA及Cofilin-1蛋白水平均高于空质粒对照组和空白细胞对照组(P0.05),且其TLR2、TLR4、TLR9蛋白表达水平和细胞凋亡水平均显著低于空质粒对照组和空白细胞对照组(P0.05)。结果表明,外源性cytD和巨噬细胞内源性高表达的Cofilin-1蛋白均可下调巨噬细胞TLR2、TLR4、TLR9的表达,其中,细胞高表达的Cofilin-1蛋白还显著降低了细胞凋亡率。该文通过揭示肌动蛋白解聚对巨噬细胞TLRs的表达及细胞凋亡的抑制,为进一步研究炎症与肿瘤的关系及分子机制奠定了基础。