高压电场不可逆电穿孔诱发A549肺癌细胞凋亡的实验研究

目的：不可逆电穿孔是治疗肿瘤的新兴技术,本文探讨高压电场引起的不可逆电穿孔诱发A549肺癌细胞凋亡的特点。方法：选择处于生长周期的A549细胞,共分为A—G7个组进行研究,其中A组为不施加电场的空白对照组,B-G组为实验组,B组施加500V／cm强度高压电场,G组施加1750V／cm的高压电场,BG组之间各组的高压电场强度间隔为250V／cm。采取细胞抑制实验、不可逆电穿孔示踪实验、细胞凋亡实验,检验A549细胞细胞凋亡与电场强度的关系。结果：①各实验组与对照组、各实验组之间的细胞抑制率,均存在显著性差异（P〈0．05）;②电场强度≥1000V／cm时,细胞不可逆电穿孔率明显增加,有统计学意义（P〈0．05）;电场强度≥1500V／cm时,细胞不可逆电穿孔率增加不明显,无统计学意义（P〉0．05）;③电场强度≥1250V／cm时,细胞早期凋亡率明显增加,有统计学意义（P〈0．05）。结论：高压电场不可逆电穿孔诱发A549肺癌细胞发生早期凋亡的强度为1250V／cm,发生晚期凋亡的强度为1500V／cm,且凋亡率随着电场强度的增加持续升高。这对于高压电场不可逆电穿孔效应引起的肿瘤细胞凋亡机制的研究具有重要意义。     

高压电场不可逆电穿孔诱发A549 肺癌细胞凋亡的实验研究

目的：不可逆电穿孔是治疗肿瘤的新兴技术,本文探讨高压电场引起的不可逆电穿孔诱发A549 肺癌细胞凋亡的特点。方 法：选择处于生长周期的A549细胞,共分为A-G7 个组进行研究,其中A组为不施加电场的空白对照组,B-G 组为实验组,B 组 施加500 V/cm 强度高压电场,G 组施加1750 V/cm的高压电场,BG 组之间各组的高压电场强度间隔为250 V/cm。采取细胞抑制 实验、不可逆电穿孔示踪实验、细胞凋亡实验,检验A549 细胞细胞凋亡与电场强度的关系。结果：①各实验组与对照组、各实验组 之间的细胞抑制率,均存在显著性差异(P<0.05);② 电场强度≥ 1000V/cm时,细胞不可逆电穿孔率明显增加,有统计学意义(P<0.05);电 场强度≥ 1500 V/cm 时,细胞不可逆电穿孔率增加不明显,无统计学意义(P＞0.05);③ 电场强度≥ 1250 V/cm时,细胞早期凋亡率 明显增加,有统计学意义(P<0.05)。结论：高压电场不可逆电穿孔诱发A549 肺癌细胞发生早期凋亡的强度为1250 V/cm,发生晚期 凋亡的强度为1500 V/cm,且凋亡率随着电场强度的增加持续升高。这对于高压电场不可逆电穿孔效应引起的肿瘤细胞凋亡机制 的研究具有重要意义。     

不同强度高压电场对A549肺癌细胞肿瘤生物学特性的影响

目的：探讨不同强度高压电场对A549肺癌细胞肿瘤转移生物学特性的影响。方法：选择处于生长周期的A549细胞,共分为7个组进行研究,其中A-F组为实验组,G组为不施加电场的空白对照组,A施加500V/cm强度高压电场,F组施加1750V/cm的高压电场,电压场强间隔为250V/cm。采取粘附实验、侵袭及转移实验,检验A549细胞在不同强度高压电场中,其肿瘤生物学转移特性的改变。结果：①各实验组与对照组、各实验组之间的细胞粘附能力,均存在显著性差异（P〈0.05）;②电场强度≥750V/cm时,各实验组之间、及其与对照组之间的细胞迁移能力,存在显著性差异（P〈0.05）;③电场强度≥1000V/cm时,各组与对照组间的细胞侵袭能力,存在显著性差异（P〈0.05）;④电场强度为1000-1250V/cm的各组与1500-1750V/cm各组间的细胞侵袭能力,存在显著性差异,有统计学意义（P〈0.05）。结论：不同强度的电场抑制A549肺癌细胞的程度不同,随着强度的增加,A549细胞粘附、迁移和侵袭能力的抑制现象依次出现,并随着电场强度的增加其抑制程度也持续增加。     

放疗与吉西他滨治疗对肺癌A549细胞自噬相关基因Beclin1表达的影响

目的:探讨放疗与吉西他滨(Gemcitabine,GEM)治疗对人肺腺癌A549细胞中自噬相关基因Beclin1表达的影响。方法:使用60Coγ照射(6Gy)人肺腺癌A549细胞,细胞继续培养6、12和24h。使用人剂量吉西他滨处理人肺腺癌A549细胞,细胞继续培养24 h后,以未处理的A549细胞为对照,用RT-PCR和Western blotting法检测A549细胞中Beclin1 m RNA和蛋白的表达。结果:经过放射线照射后,三组A549细胞内Beclin1 m RNA和蛋白的表达量均增加,且在24小时末表达量达到最大。经过吉西他滨处理后,吉西他滨处理组A549细胞内Beclin1 m RNA和蛋白的表达量均增加。结论:放射治疗与吉西他滨治疗均可导致A549细胞内自噬相关基因Beclin1表达上调。     

TRBP2基因过表达对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制

该文探讨了TAR RNA结合蛋白2(TAR RNA binding protein 2,TRBP2)基因对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制。构建TRBP2慢病毒过表达载体,以不同感染复数(MOI)感染A549细胞,根据绿色荧光强度选择最适MOI值。荧光定量PCR(FQ-PCR)检测TRBP2、MMP-2(matrix metalloproteinase-2)、PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)m RNA的表达量。免疫蛋白印记(Western blot)法检测TRBP2、MMP-2、PKR、p-PKR的表达。采用MTT法、平板克隆实验检测TRBP2基因对A549细胞增殖的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,黏附实验检测同种细胞和异种细胞间黏附情况。结果发现,成功构建了TRBP2基因过表达的A549细胞株,与空载体组和对照组比较,TRBP2基因过表达组细胞侵袭、迁移能力明显增强(P0.05),同种细胞间黏附力减弱(P0.05)而异种细胞间黏附力增强(P0.05),增殖速度加快(P0.05)及克隆形成率增加(P0.05)。此外,MMP-2、TRBP2蛋白及m RNA表达量明显升高(P0.05);p-PKR蛋白表达量降低(P0.05);PKR蛋白及m RNA表达量无差异。对照组与空载体组之间比较,以上各项指标均没有明显差异(P0.05)。该研究表明,过表达TRBP2基因可能通过促进MMP-2的表达同时抑制PKR磷酸化来促进肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭。     

稳定高表达人ERP57基因A549细胞株的建立及其对CRT表达的影响

建立稳定高表达人ERP57蛋白的A549细胞株,并观察对CRT表达的影响。采用巢式RT-PCR从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人ERP57 cDNA,构建ERP57真核表达质粒(pcDNA3.1(+)/ERP57)脂质体转染A549细胞。经G418筛选,获得高表达人ERP57蛋白的A549细胞株。通过Western blotting检测细胞中ERP57及CRT蛋白表达情况。成功获得稳定高表达ERP57蛋白的人A549细胞株,CRT表达量无明显改变。成功获得稳定高表达ERP57蛋白的人A549细胞株,证实细胞中高表达ERP57对CRT表达量无明显影响。     

CRISPR/Cas9技术介导的稳定沉默LDHA表达对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定沉默乳酸脱氢酶A(LDHA)的A549细胞系,并探讨LDHA沉默对细胞增殖能力的影响。方法:构建特异性靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA,转染A549细胞后经嘌呤霉素筛选获得LDHA沉默的稳定细胞株,并用定量PCR和免疫印迹实验分别检测LDHA m RNA和蛋白的沉默效率。利用MTT法检测A549细胞的增殖情况。结果:测序结果证实,CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA构建成功;筛选出LDHA沉默A549细胞株,定量PCR和免疫印迹实验证实LDHA m RNA和蛋白的表达量均明显下调。MTT法证实:培养24,48,72h后,LDHA沉默A549细胞与对照细胞相比,其增殖被抑制。结论:转染靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体,可明显下调LDHA m RNA和蛋白表达,抑制肺癌细胞A549的增殖。     

V-ATPase:结构、功能及其在肿瘤细胞中的作用

真核细胞膜及管泡细胞器膜上广泛分布一种与H^ 主动转运有关的蛋白——V-ATPase。V-ATPase的结构由跨膜的V0和细胞质内的V1两个亚单位组成,前者为H^ 提供通道,后者能分解ATP,为逆浓度梯度转运H^ 提供能量。V0和V1只有在聚合时,V-ATPase全酶才有功能。肿瘤细胞中V-ATPase的过度表达或过度活跃,遏制了由酵解增强乳酸聚集导致的细胞内酸化趋势,使细胞避免了凋亡的命运。而H^ 排至细胞外,改变蛋白水解酶的活性,使细胞外基质分解增强,细胞更有侵袭力。肿瘤细胞的V-ATPase可望成为抑制细胞增生、扩散的有效靶点。     

激活谷氨酸促代谢型受体8促进肺腺癌A549细胞凋亡

本文旨在检测谷氨酸促代谢型受体(metabotropic glutamate receptors,mGluR)各亚型在肺腺癌A549细胞中的表达,并进一步探讨呈高表达的mGluR8和mGluR4激活对A549细胞体外生长的影响。采用real-time PCR技术检测A549细胞mGluR各亚型的m RNA表达,采用免疫组化技术检测A549细胞以及肺腺癌组织mGluR8和mGluR4蛋白表达。采用CCK-8试剂盒检测细胞生长,EdU掺入检测细胞DNA合成率,hoechst 33258染色及流式细胞仪检测细胞的凋亡的变化,分别观察mGluR8的激动剂(S)-3,4-DCPG及mGluR4的激动剂VU0155041对A549细胞生长的影响。结果显示:A549细胞I组促代谢型受体mGluR1和mGluR5m RNA呈低水平表达,II组促代谢型受体mGluR2和mGluR3 mRNA无表达,III组促代谢型受体mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8 m RNA均有表达,其中以mGluR8的m RNA表达水平最高,mGluR4表达次之;A549细胞及部分患者肺腺癌组织上有mGluR4和mGluR8的蛋白表达。VU0155041对A549细胞的体外生长无明显影响,而(S)-3,4-DCPG呈剂量依赖性抑制A549细胞的生长,并促进其凋亡。这些结果揭示mGluR8激活具有抑制肺癌细胞生长作用,为肺癌防治的研究提供新的线索。     

人胚胎干细胞对A549、HepG2细胞增殖与凋亡的影响

本研究以探讨人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)对肿瘤细胞A549、Hep G2增殖与凋亡的影响为目的,以h ESCs、A549细胞、Hep G2细胞作为研究对象,采用transwell小室在体外分别建立h ESCs与A549、Hep G2细胞的非接触式共培养的方法,设置Co-A549、Co-Hep G2作为实验组,单独培养的A549、Hep G2细胞作为对照组,采用CCK-8法检测细胞增殖水平,Hochest33258染色和流式细胞术检测细胞的凋亡,q RT-p CR和Western blotting检测Bcl2、Bax及Caspase-3的m RNA转录水平和蛋白表达水平。CCK-8检测显示,实验组细胞的增殖受到显著抑制(p0.05),Hochest33258染色观察到实验组细胞出现核固缩、变形,流式细胞术检测到实验组细胞的凋亡率显著高于对照组(p0.05),q RT-p CR和Western blotting显示h ESCs可上调实验组细胞Bax、Caspase-3的表达,下调Bcl2的表达(p0.05)。由此我们得到人胚胎干细胞对肿瘤细胞A549、Hep G2有明显的增殖抑制作用并可诱导A549、Hep G2肿瘤细胞的凋亡的结论,为干细胞治疗肿瘤的研究奠定了实验基础。     

Characterization of a stem cell population in lung cancer A549 cells

We isolated a stem cell subpopulation from human lung cancer A549 cells using FACS/Hoechst 33342. This side population (SP), which comprised 24% of the total cell population, totally disappeared after treatment with the selective ABCG 2 inhibitor fumitremorgin C. In a repopulation study, isolated SP and non-SP cells were each able to generate a heterogeneous population of SP and non-SP cells, but this repopulation occurred more rapidly in SP cells than non-SP. An MTT assay and cell cycle distribution analysis reveal a similar profile between SP and non-SP groups. However, in the presence of doxorubicin (DOX) and methotrexate (MTX), SP cells showed significantly lower Annexin V staining when compared to non-SP cells. Taken together, these results demonstrate that SP cells have an active regeneration capacity and high anti-apoptotic activity compared with non-SP cells. Furthermore, our GeneChip^® data revealed a heightened mRNA expression of ABCG2 and ABCC2 in SP cells. Overall these data explain why the SP of A549 has a unique ability to resist DOX and MTX treatments. Therefore, we suggest that the expression of the ABCG2 transporter plays an important role in the multidrug resistance phenotype of A549 SP cells.     

CD44 and CD24 cannot act as cancer stem cell markers in human lung adenocarcinoma cell line A549

Cancer stem cells (CSCs) are subpopulations of tumor cells that are responsible for tumor initiation, maintenance and metastasis. Recent studies suggested that lung cancer arises from CSCs. In this study, the expression of potential CSC markers in cell line A549 was evaluated. We applied flow cytometry to assess the expression of putative stem cell markers, including aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1), CD24, CD44, CD133 and ABCG2. Cells were then sorted according to the expression of CD44 and CD24 markers by fluorescence-activated cell sorting (FACS) Aria II and characterized using their clonogenic and sphere-forming capacity. A549 cells expressed the CSC markers CD44 and CD24 at 68.16% and 54.46%, respectively. The expression of the putative CSC marker ALDH1 was 4.20%, whereas the expression of ABCG2 and CD133 was 0.93%. Double-positive CD44/133 populations were rare. CD44⁺/24⁺ and CD44⁺/CD24^?/low subpopulations respectively exhibited 64% and 27.92% expression. The colony-forming potentials in the CD44⁺/CD24⁺ and CD44⁺/CD24^?/low subpopulations were 84.37 ± 2.86% and 90 ± 3.06%, respectively, while the parental A549 cells yielded 56.65 ± 2.33% using the colony-formation assay. Both isolated subpopulations formed spheres in serumfree medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF). CD44 and CD24 cannot be considered potential markers for isolating lung CSCs in cell line A549, but further investigation using in vivo assays is required.     

Claudin-2 knockdown decreases matrix metalloproteinase-9 activity and cell migration via suppression of nuclear Sp1 in A549 cells

AimsClaudin expression is altered in lung cancer, but the pathophysiological role of claudin is not well understood. We examined the effect of claudin-2 expression on cell migration using human adenocarcinoma A549 cells.Main methodsThe mRNA level was measured by real time polymerase chain reaction. To knockdown claudin-2 expression, we made the cells expressing doxycycline-inducible claudin-2 shRNA vector. The protein level was examined by Western blotting. Cell migration was measured by wound-healing assay. The enzymatic activity of MMP-9 was assessed by gelatin zymography.Key findingsIn A549 cells, claudin-2 expression was higher than in normal lung tissue. Claudin-2 knockdown did not affect the expression of other junctional proteins including claudin-1, occludin and E-cadherin. Claudin-2 knockdown decreased cell migration concomitant with a decrease in the mRNA level and enzymatic activity of MMP-9. The expression level of Sp1 in the nuclei was decreased by claudin-2 knockdown. In contrast, the expression levels of c-Fos, c-Jun and NF-kB p65 in the nuclei were not changed by claudin-2 knockdown. The knockdown of Sp1 expression by siRNA decreased cell migration, and the mRNA expression, enzymatic activity, and promoter activity of MMP-9.SignificanceClaudin-2 may increase the mRNA level and enzymatic activity of MMP-9 mediated by the elevation of nuclear distribution of Sp1, resulting in the up-regulation of A549 cell migration.     

KEAP1基因及其突变位点对非小细胞肺癌细胞株作用的实验初步研究

摘要 目的：研究KEAP1基因及KEAP1基因突变位点对肺癌细胞株的作用。方法：通过Western blot 方法,比较携带KEAP1 基因突变的肺癌细胞株（A549,NCI-H460,NCI-H838）与KEAP1 基因野生型的肺癌细胞株（NCI-H292, NCI-H1299, 95D, SPC-A1）之间,NRF2基因与NRF2下游基因HO-1的蛋白表达水平,检测并比较两组细胞的活性氧（ROS）含量;以新发现的非小细胞肺癌（NSCLC）病人的 KEAP1 体细胞突变作为模板构建 KEAP1 突变质粒,对自身存在 KEAP1 突变的肺癌细胞株A549,通过改造的 pMSCV 逆病毒转染体系,分别构建过表达空载,野生型及突变型 KEAP1 的 A549 稳定细胞株,比较过表达不同质粒的细胞间丙二醛（MDA）含量及 NRF2 下游抗氧化等相关基因的表达水平;通过克隆形成实验检测细胞增殖情况。结果：KEAP1基因突变组肺癌细胞株与KEAP1基因无突变的对照组细胞株相比,NRF2和HO-1蛋白表达显著增高,活性氧水平显著降低（P<0.01）;过表达野生型KEAP1 与过表达空载的 A549细胞相比,NRF2 及其下游基因转录水平表达显著下降（P<0.01）,蛋白水平表达下降,细胞内丙二醛水平显著增高（P<0.01）,克隆形成率显著降低（P<0.01）,而过表达突变型 KEAP1 与过表达空载的 A549细胞相比,NRF2 及其下游基因表达、细胞内丙二醛水平、克隆形成率均无显著差异（P>0.05）。结论：KEAP1基因具有抑癌作用,其突变为失活型突变,突变后KEAP1/NRF2通路激活,KEAP1基因突变可能通过改变细胞的氧化应激水平,促进肺癌的发生发展。     

Egr-1基因沉默对A549细胞放射敏感性的影响

目的:探讨Egr-1基因沉默对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响。方法:选用A549细胞株作为研究对象,将其分成A、B、C三组,即空白对照组(只加入RPMI-1640培养)、阴性对照组(加入LV3-NC-sh RNA)、实验组(加入EGR1-homo-2294-sh RNA),采用慢病毒介导的sh RNA干扰技术使实验组细胞Egr-1基因沉默表达。利用荧光显微镜、自动化荧光定量细胞成像分析系统分析sh RNA转染,利用FQ-PCR分析Egr-1表达,再利用细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感性参数的差异。结果:慢病毒介导的sh RNA成功转染阴性对照组、实验组细胞;空白对照组与阴性对照组Egr-1表达无差异(P0.05),实验组与空白对照组、阴性对照组比较Egr-1均受到明显抑制(P0.05);克隆形成实验中细胞放射敏感性参数D0、SF2实验组细胞与空白对照组、阴性对照组比较均存在明显差异(P0.05)。结论:Egr-1基因沉默使A549细胞放射敏感性降低,Egr-1表达可能与肿瘤细胞对放射的敏感性有关。     

余甘子提取物调控LINC01772/miR-153对肺癌细胞A549生物学行为的影响

摘要 目的：探讨余甘子提取物对肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法：体外培养A549细胞,分为对照组、不同剂量（低、中、高剂量）余甘子提取物组、si-NC组、si-LINC01772组、高剂量余甘子提取物+pcDNA组和高剂量余甘子提取物+pcDNA-LINC01772组,细胞计数试剂盒（CCK-8）法和克隆形成实验检测细胞增殖,划痕实验检测细胞迁移,嵌入式细胞共培养法（Transwell）检测细胞侵袭,免疫印迹法（Western Blot）检测细胞中上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）和神经型钙黏蛋白（N-cadherin）蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测LINC01772和miR-153表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证LINC01772和miR-153调控关系。结果：与对照组相比,不同剂量余甘子提取物组A549细胞中LINC01772表达降低,且光密度值（OD值）、克隆形成数、迁移以及侵袭细胞数减少（P<0.05）,而miR-153含量与E-cadherin蛋白表达升高（P<0.05）,且呈剂量依赖性（P<0.05）。LINC01772在A549细胞中负调控miR-153表达。与si-NC组相比,si-LINC01772组A549细胞增殖,侵袭及迁移能力受到抑制（P<0.05）。与高剂量余甘子提取物+pcDNA组相比,高剂量余甘子提取物+pcDNA-LINC01772组A549细胞增殖,侵袭及迁移能力增强（P<0.05）。结论：余甘子提取物可能通过调控LINC01772/miR-153轴抑制肺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭,其可能通过下调LINC01772进而上调miR-153表达发挥作用,具有开发为治疗肺癌药物的潜在价值。     

内吞适配蛋白Epsin在非小细胞肺癌发生中的作用研究

目的:探讨内吞适配蛋白Epsin在非小细胞肺癌发生中的潜在作用。方法:选择体外培养的人非小细胞肺癌细胞(A549),筛选Epsin 1和Epsin 2 shRNA干扰效率达标的细胞。将裸鼠随机分为3组,每组10只,第1、2组裸鼠分别经胸腔植入人非小细胞肺癌细胞(A549)及epsin表达敲减的A549细胞,第3组注射等量的生理盐水,比较1、2组小鼠肿瘤体积的变化。8周后,处死所有裸鼠,留取肺组织及肿瘤组织,通过免疫荧光染色检测非肿瘤(正常)肺和致瘤性肺组织中的epsin 1和2的蛋白质水平。用实时定量PCR(qRT-PCR)来研究epsin 1和2的基因表达水平。结果:肺肿瘤组织epsin1和2的m RNA和蛋白表达均显著高于正常肺组织中(P0.05)。种植epsin表达敲减的A549细胞裸鼠肿瘤生长速度及体积均大于种植正常A549细胞的裸鼠肿瘤。结论:Epsins表达上调可能促进非小细胞肺癌肿瘤的发生发展,而敲减epsins的表达可能为未来的非小细胞肺癌的治疗提供新的治疗靶点。