药用野生稻GBSS基因的系统发育及组织特异性表达

淀粉作为主要的碳水化合物在储藏能量方面发挥至关重要的作用。颗粒结合型淀粉合酶(GBSS)与直链淀粉的合成息息相关。尽管该酶的编码基因已在许多栽培植物中被分离和确定, 但有关它们在作物野生近缘种中的序列分歧和表达的研究却相对较少。该研究以药用野生稻(Oryza officinalis)为研究对象, 定性和定量地分析了GBSS编码基因的序列特点、与其它植物同源基因的进化关系以及在叶和种子中的表达情况。系统发育分析表明, 该酶在禾本科植物中分别由GBSSI和GBSSII基因编码。在药用野生稻中, 这2种基因所编码蛋白的氨基酸序列一致性为62%, 并且它们在不同器官内呈现时空分化表达, 其中GBSSI在种子中超强表达, GBSSII则主要在叶片表达。     

药用野生稻叶中淀粉合成酶基因家族的序列分化和特异表达

淀粉不仅是植物自身和后代生长繁殖的重要营养与能量储备,而且是人类膳食中碳水化合物的主要来源。植物中淀粉合成主要发生在两个阶段,一是在形成临时淀粉的光合作用阶段,另一个则是在成为贮藏淀粉的营养积累阶段。相对于最后的淀粉贮藏阶段,临时淀粉的形成阶段在植物整个碳水化合物代谢过程中扮演着更为重要的角色,然而却一直少有关注。为深入研究初始淀粉合成过程中相关酶在植物中的进化模式,选取了药用野生稻(Oryza officinalis)为研究对象,通过对其全叶转录组的重测序,定性、定量地调查了淀粉合成酶基因家族在稻属野生物种光合器官中的基因类型和表达变化。共有8个淀粉合成酶基因的完整编码序列在药用野生稻的叶中首次被识别。系统发育分析表明,这8个基因分别隶属SSI、SSII、SSIII、SSIV、SSV和GBSSII基因家族。序列比较和相对表达定量分析显示,药用野生稻与栽培稻的淀粉合成酶基因家族的进化模式具有高度的一致性,两个物种的同源基因在m RNA水平的序列相似度达到95%–98%。基于非同义置换和同义置换比率的统计检验表明,8个基因在两个物种间均经历了严格的纯化选择。另外,3个在栽培稻胚乳中特异表达的基因在药用野生稻的叶转录组中未筛查出来,而4个在栽培稻叶中优势表达的基因在药用野生稻叶中同样呈现相对较高水平的表达。     

灵芝β-葡萄糖苷酶基因的克隆与功能分析

灵芝是我国著名的药用真菌,具有抗癌、抗肿瘤等功效。灵芝酸属于三萜类化合物,是灵芝的主要活性成分,并已成为评价灵芝品质的重要指标之一。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)是次生代谢产物合成途径中的关键限速酶,能够调节次生代谢产物的生物合成。本研究通过同源序列比对,注释获得了灵芝β-葡萄糖苷酶基因(GlBG),并通过RNAi技术对灵芝β-葡萄糖苷酶进行功能分析。序列分析结果显示GlBG基因的DNA全长为2 759 bp,包含7个外显子和6个内含子,编码793个氨基酸,其编码的蛋白序列中含有β-糖苷水解酶的2个保守结构域。灵芝β-葡萄糖苷酶基因的沉默转化子中灵芝酸含量比野生型菌株的灵芝酸含量平均降低了38%,并且灵芝酸生物合成途径中的关键酶基因(hmgs、hmgr、fps、sqs和osc)的表达量也显著下降,实验结果表明灵芝β-葡萄糖苷酶在灵芝酸生物合成过程中具有重要作用,并为灵芝次生代谢途径及其调控机制提供了参考。     

细叶百合LpPEX7基因克隆及盐胁迫下的表达特性分析

从细叶百合的鳞茎中克隆出过氧化物酶体生物合成蛋白基因（LpPEX7）,该基因ORF全长957 bp,编码318个氨基酸。LpPEX7蛋白序列包含6个WD40保守结构域,通过同源蛋白序列比对和进化树分析,发现LpPEX7与其他植物的PEX7蛋白具有较高的同源性。LpPEX7基因在细叶百合种子,叶片和鳞茎中的表达量比较高,在根和花中表达量比较低,在H₂O₂,NaCl,NaHCO₃不同逆境处理条件下,LpPEX7基因的表达量都发生了改变。在盐碱和氧化胁迫处理下,LpPEX7过表达拟南芥株系种子的萌发要早于野生型种子的萌发,这些研究结果表明LpPEX7基因与盐碱、氧化逆境有一定的应答关系,为细叶百合的耐盐碱性分子机理研究提供一个非常重要的候选基因。     

玉米种子发育过程中直链淀粉积累规律的分析

淀粉是玉米种子的主要组成成分,它包括直链淀粉和支链淀粉。支链淀粉的合成需要淀粉合成酶、分支酶和脱支酶的共同作用,而直链淀粉的合成则是在颗粒结合型淀粉合成酶的作用下进行的。颗粒结合型淀粉合成酶基因的突变造成玉米种子的腊质（糯性）表型。与支链淀粉合成的分子机制的研究相比,目前对玉米种子中直链淀粉合成的分子机制了解相对较少。以野生型黄早4玉米自交系和突变体糯玉米为实验材料,研究了种子不同发育时期直链淀粉的积累规律。通过碘染色的方法,观察了玉米种子发育过程中淀粉积累的形态变化。定量分析表明,从授粉后10d至25d,黄早4种子中直链淀粉的含量逐渐增加,同时颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）的活性逐渐提高;而在糯玉米中,直链淀粉和GBSS活性均未检测到。进而,通过RT-PCR方法,从黄早4种子中分离出编码GBSSI的cDNA片段。在授粉后10d至25d的玉米胚乳中均可检测到GBSSI的表达,而在胚中直到授粉后25d才检测到该基因表达的微弱信号。在糯玉米种子中没有检测到该基因的表达。研究结果表明,在玉米种子发育过程中,GBSSI基因的表达通过控制GBSS的合成,最终控制直链淀粉的合成。研究工作为理解玉米种子中直链淀粉合成的分子机制提供了重要信息。     

植物颗粒结合淀粉合成酶(GBSS)基因的表达调控机制研究进展

颗粒结合淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS)是决定直链淀粉合成的关键酶,单子叶植物GBSS包含两种同工酶,分别是GBSSI和GBSSII,双子叶植物只有GBSSII一种同工酶。GBSSI基因的表达主要控制种子、胚、胚乳等贮藏器官中直链淀粉的合成,而GBSSII主要控制根、茎、叶等营养器官中直链淀粉的合成。综述了模式植物及农作物中GBSS基因表达调控机制的最新研究进展,以期为其他植物GBSS基因的研究提供借鉴。     

百合鳞茎发育过程中淀粉合成相关酶基因的克隆及表达分析

该研究通过同源克隆技术克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、颗粒结合淀粉合酶(GBSS)和可溶性淀粉合酶(SSS) 3类百合淀粉合成关键酶基因,分析这三类淀粉合成关键酶基因的表达变化,测定百合鳞茎膨大发育中淀粉含量变化。结果表明:(1) AGPase具有GlgC家族蛋白PLN02241蛋白结构特征及cl11394家族蛋白ADP_Glucose_PP与NTP_transferase结构域,获登录号KP751443; GBSS与SSS具有cl10013家族蛋白Glyco_transf_5,GT1_Glycogen_synthase_DULL1_like结构域,获登录号分别为KP751444、KP751445。(2)百合鳞茎形成与膨大发育过程中,淀粉含量呈现递增趋势,鳞茎盘开始分化茎杆时其淀粉含量最高,达到44.52%。鳞茎与叶片部位的三个淀粉合成相关酶基因表达量均逐渐增加;在鳞茎膨大后茎杆分化阶段,三个淀粉合成相关酶基因表达量达到最高,AGPase、GBSS、SSS在鳞片中的表达量分别为10.79,6.92和5.12,叶片中的表达量分别为6.79,5.22和4.41,鳞片中的表达量大幅度高于叶片;淀粉合成相关酶基因的表达量变化与淀粉含量、鳞茎的膨大发育成正相关。这为鳞茎的繁殖生产提供了可通过调节淀粉合成关键酶基因表达促进百合鳞茎膨大发育的思路。     

金针菇细胞色素c过氧化物酶基因（ffccp）及其在菌柄伸长的差异表达初步分析

细胞色素c过氧化物酶（cytochrome C peroxidase,CcP）是细胞内H₂O₂的主要降解酶,参与真菌的氧化应答过程。本研究基于基因组数据获得一个金针菇细胞色素c过氧化物酶编码基因,命名为ffccp。该基因全长1 913bp,包含一个1 098bp的完整开放阅读框,编码365个氨基酸。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质（FfCcP）无跨膜结构和信号肽,不形成二硫键结构,亚细胞定位于线粒体上,具备血红素结合蛋白的保守位点。序列比对和进化分析结果显示,金针菇与糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等大型真菌的CcP序列高度相似（相似度均超过70%）,属于CcP家族蛋白。RT-qPCR的检测结果显示,氧化胁迫和损伤胁迫均能诱导ffccp基因上调表达,但两种胁迫对ffccp表达的调控机制可能并不相同。进一步检测ffccp在子实体发育过程中的差异表达情况,发现ffccp在伸长期菌柄出现显著上调表达,且表达量与菌柄伸长速度的相关性达到0.998,为极强正相关。推测ffccp的上调表达可能有利于菌柄的伸长。     

植物颗粒结合淀粉合酶GBSS基因家族的进化

为全面理解植物颗粒结合淀粉合酶(GBSS)基因在植物中的进化模式并重建其进化历史, 利用20种陆生植物和2种藻类植物的基因组数据, 通过生物信息学手段, 深入挖掘和分析植物类群基因组中GBSS基因家族的构成和基因特点, 推测其可能的扩增和丢失规律。结果共识别42条同源序列。系统发育和进化分析表明, GBSS基因起源古老, 可能在所有绿色植物的祖先中就已经出现, 之后在进化过程中不断发生谱系的特异扩张和拷贝丢失, 并最终通过功能分化的形式在植物类群中被固定。     

云南疣粒野生稻稻瘟病抗性

野生稻(Oryza rufipogo)保存有许多栽培稻(O. sativa)不具备或已经消失的优异基因资源, 是扩大栽培稻遗传背景、改良产量与品质、提高抗病虫害及抗逆境能力的重要基因库。疣粒野生稻(O. meyeriana)是中国3种野生稻资源之一, 主要分布在云南。为进一步了解其稻瘟病抗性, 首先利用来自不同稻作区的稻瘟病菌株, 通过注射接种法对疣粒野生稻进行系统的稻瘟病抗性鉴定, 发现疣粒野生稻对接种的所有稻瘟病菌株都感病。进一步采用3'/5' RACE方法, 从疣粒野生稻中克隆了水稻同源基因Pid2和Pid3, 并构建过表达转基因株系对基因功能进行了研究。结果表明, Pid2和Pid3与疣粒野生稻中同源基因间在DNA和氨基酸水平上有较大的序列差异, 过表达转基因的日本晴植株对稻瘟病菌的敏感性与对照相似。推测疣粒野生稻在自然接种条件下, 表现出的抗稻瘟病表型很可能是其旱生叶片结构特征形成了对稻瘟病菌侵染的天然屏障。对控制疣粒野生稻这一类性状基因资源的挖掘和利用, 有利于优良抗性水稻品种的培育。研究结果为疣粒野生稻的研究利用提供了新信息和新思路。     

入侵植物与本地植物互作对丛枝菌根真菌AMF侵染率的影响

外来植物成功入侵与菌根共生体存在着密不可分的关系,丛枝菌根真菌（AMF）侵染率是反映其侵染植物情况的重要指标,影响侵染率的因素很多,但是入侵植物与本地植物互作对AMF侵染率的影响目前还不清楚。因此,本研究以外来入侵植物黄顶菊Flaveria bidentis、豚草Ambrosia artemisiifolia、三叶鬼针草Bidens pilosa和本地植物狗尾草Setaria viridis、黄香草木犀Melilotus officinalis、藜Chenopodium album为研究对象,设置入侵植物单种处理、本地植物单种处理、每种入侵植物分别与本地植物两两混种处理以及每种入侵植物同时与所有本地植物混种处理,观察测定不同处理下入侵植物与本地植物根系丛枝、泡囊、菌丝及总侵染率,比较研究本地植物种类变化对入侵植物和本地植物根系AMF侵染率的影响,以及3种入侵菊科植物对本地植物AMF侵染率的影响规律是否一致。结果表明,与入侵植物单种相比,除豚草与藜、豚草同时与3种本地植物混种两个处理中,豚草根系的AMF菌丝及总侵染率显著增加外,其余所有处理中入侵植物总侵染率均无显著差异;与狗尾草或黄香草木犀单种相比,每种入侵植物同时与所有本地植物混种处理中,本地植物狗尾草和黄香草木犀根系上的AMF菌丝及总侵染率均显著降低,即随本地植物种类数目的增加,对本地植物根系的菌丝及总侵染率存在显著抑制作用,而对入侵植物无显著影响。     

9种唇形科芳香植物挥发性萜类成分的比较分析

采用正己烷萃取法，结合GC-MS（气相色谱-质谱联用）技术，并通过谱库、保留指数和文献检索定性，内标法定量，分析9种唇形科芳香植物叶片的挥发性萜类成分并比较其差异，所得结果不仅为芳香植物的高效利用、合理开发提供参考，还为植物萜类的代谢研究提供依据。结果显示：从9种芳香植物中共检测到77种挥发性萜类物质，藿香中检测到的种类最多，为46种，迷迭香（35种）、百里香（33种）、药用鼠尾草（33种）和美国薄荷（31种）次之，石竹烯和蛇麻烯为9种植物共有成分。迷迭香中检测到的挥发性萜类的含量最高，其次是药用鼠尾草和藿香。单萜类成上分明显高于倍半萜类，因此迷迭香、药用鼠尾草、藿香、百里香和美国薄荷，较适宜作为提取挥发性萜类的材料；香蜂花只适宜柠檬醛的提取，牛至、凤梨鼠尾草和南欧丹参不适宜作为提取挥发性萜类的材料。上述芳香植物在正常环境中生成单萜类化合物的能力高于生成倍半萜类化合物的能力，可能与其含有的萜类合酶有关。     

Field evaluation of transgenic potato plants expressing an antisense granule-bound starch synthase gene: increase of the antisense effect during tuber growth

Transgenic plants of a tetraploid potato cultivar were obtained in which the amylose content of tuber starch was reduced via antisense RNA-mediated inhibition of the expression of the gene encoding granule-bound starch synthase (GBSS). GBSS is one of the key enzymes in the biosynthesis of starch and catalyses the formation of amylose. The antisense GBSS genes, based on the full-length GBSS cDNA driven by the 35S CaMV promoter or the potato GBSS promoter, were introduced into the potato genome by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Expression of each of these genes resulted in the complete inhibition of GBSS gene expression, and thus in the production of amylose-free tuber starch, in mature field-grown plants originating from rooted in vitro plantlets of 4 out of 66 transgenic clones. Clones in which the GBSS gene expression was incompletely inhibited showed an increase of the extent of inhibition during tuber growth. This is likely to be due to the increase of starch granule size during tuber growth and the specific distribution pattern of starch components in granules of clones with reduced GBSS activity. Expression of the antisense GBSS gene from the GBSS promoter resulted in a higher stability of inhibition in tubers of field-grown plants as compared to expression from the 35S CaMV promoter. Field analysis of the transgenic clones indicated that inhibition of GBSS gene expression could be achieved without significantly affecting the starch and sugar content of transgenic tubers, the expression level of other genes involved in starch and tuber metabolism and agronomic characteristics such as yield and dry matter content.     

入侵豚草与本地植物竞争对丛枝菌根真菌多样性的影响

外来植物入侵常引起入侵地丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi,AMF）多样性的变化,但AMF多样性的变化与入侵域本地植物种类相关性目前尚不清楚。本研究采用野外同质园试验研究豚草与不同本地植物竞争时对AMF多样性的影响。本试验共设入侵豚草单种、本地植物狗尾草Setaria viridis单种、藜 Chenopodium album单种、黄香草木犀Melilotus officinalis单种、豚草和狗尾草混种、豚草和藜混种、豚草和黄香草木犀混种以及裸土（无任何植物生长）对照8个处理。采集根区土样后分离、鉴定AMF,分析植株生物量和AMF物种多样性变化间的关系。结果表明,对豚草而言,单种处理中生物量均高于混种处理;豚草分别与3种本地植物竞争时,与黄香草木犀混种中豚草竞争能力最强,而与藜混种中竞争能力最弱。豚草分别与3种本地植物混种时土壤中AMF种丰度和香农-威纳指数分别显著高于豚草单种和本地植物单种,其中豚草与藜混种中AMF的种丰度和香农-威纳指数最高,与狗尾草混种中AMF的种丰度和香农-威纳指数最低,而豚草分别与3种本地植物混种处理中孢子密度显著低于本地植物单种（豚草与黄香草木犀混种除外）。豚草单种、狗尾草单种、藜单种、豚草分别与狗尾草和藜混种4个处理中AMF优势种均为网状球囊霉Glomus reticulatum和缩隔球囊霉Septoglomus constrictum;黄香草木犀单种中优势种是网状球囊霉、缩隔球囊霉和根内根孢囊霉Rhizophagus Intraradices,豚草与黄香草木犀混种中优势种是网状球囊霉和根内根孢囊霉;狗尾草单种、豚草与狗尾草混种和豚草与藜混种3个处理的特有种分别是木薯根孢囊霉Rhizoglomus manihotis、近明球囊霉Claroideoglomus claroideum和美丽盾巨孢囊霉Scutellospora calospora。狗尾草单种生物量与孢子密度呈显著正相关,豚草与狗尾草混种中豚草的生物量与均匀度呈显著负相关,豚草与黄香草木犀混种中豚草的生物量与孢子密度呈显著正相关,与香农威纳指数呈显著负相关。综上可知,豚草与本地植物竞争对AMF多样性的影响具有异质性,这与本地植物种类密切相关。     

Expression of a wild-type GBSS gene introduced into an amylose-free potato mutant by Agrobacterium tumefaciens and the inheritance of the inserts at the microsporic level

Granule-bound starch synthase (GBSS) catalyses the synthesis of amylose in starch granules. Transformation of a diploid amylose-free (amf) potato mutant with the gene encoding GBSS leads to the restoration of amylose synthesis. Transformants were obtained which had wild-type levels of both GBSS activity and amylose content. It proved to be difficult to increase the amylose content above that of the wild-type potato by the introduction of additional copies of the wild-type GBSS gene. Staining of starch with iodine was suitable for investigating the degree of expression of the inserted GBSS gene in transgenic amf plants. Of the 19 investigated transformants, four had only red-staining starch in tubers indicating that no complementation of the amf mutation had occured. Fifteen complemented transformants had only blue-staining starch in tubers or tubers of different staining categories (blue, mixed and red), caused either by full or partial expression of the inserted gene. Complementation was also found in the microspores. The segregation of blue- and red-staining microspores was used to analyse the inheritance of the introduced GBSS genes. A comparison of the results from microspore staining and Southern hybridisation indicated that, in three tetraploid transgenics, the gene was probably inserted before (duplex), and in all others after, chromosome doubling (simplex). The partial complementation was not due to methylation of the HPAII/MSPI site in the promoter region. Partially complemented plants had low levels of mRNA as was found when the GBSS expression levels were inhibited by anti-sense technology.     

Antiviral activity of the volatile oils of Melissa officinalis L. against Herpes simplex virus type-2

Melissa officinalis L. (Lamiaceae) has been used in a variety of practical applications in medical science. Our objective in the current study was to determine the effects of the volatile oil components of M. officinalis on Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) replication in HEp-2 cells. Four different concentrations (25, 50, 100, 150 and 200 μg/ml) of volatile oils were examined. Experiments were carried out using HEp-2 cells. M. officinalis volatile oil was found to be non-toxic to HEp-2 cells up to a concentration of 100 μg/ml. It was, however, found to be slightly toxic at a concentration over of 100 μg/ml. The antiviral activity of non-toxic concentrations against HSV-2 was tested. The replication of HSV-2 was inhibited, indicating that the M. officinalis L. extract contains an anti-HSV-2 substance.