芥蓝miR172家族成员进化特性比较及时空表达分析

为了明确植物miR172家族成员的进化特性及其在不同组织部位的表达情况,该研究以芥蓝miR172a家族为例,通过芥蓝miR172a成熟体序列比对、前体(pre-miRNA)二级结构预测、系统发育进化树构建、靶基因预测及实时荧光定量等手段,对芥蓝miR172a和miR172b基因家族的进化特性及其在芥蓝不同组织部位中的表达规律进行分析。结果显示:(1)芥蓝miR172家族存在20个成熟体成员,通过比对发现20条序列都存在一个重叠区域,该区域中ACTAGATC 8个碱基高度保守,并且在芥蓝pre-miR172的3′和5′端均能形成成熟体。(2)mfold预测结果显示,miR172a家族5个前体成员的最小折叠自由能在-54.55~-78.60kal/mol之间,均能自发形成典型、稳定的茎环二级结构。(3)系统发育进化树显示,芥蓝miR172a家族的前体成员具有一定的保守性和多样性,并与番木瓜pre-miR172a亲缘关系较近。(4)靶基因预测发现芥蓝miR172a共有13个不同靶标基因,多个成员也可以作用于相同靶标基因。(5)实时荧光定量PCR显示,芥蓝pre-miR172a和pre-miR172b家族不同成员在不同组织部位表达量差异显著,10个成员在9个组织部位中的表达各不相同。其中,芥蓝pre-miR172a-1、pre-miR172a-2、premiR172a-3和pre-miR172b在芥蓝荚中大量表达;pre-miR172b-5p和pre-miR172b-5p-2在芥蓝花中大量表达。研究表明,miR172在芥蓝花和荚的发育过程中起着重要的作用。     

龙眼DCL家族基因的启动子分析及时空表达

为了解龙眼DCL基因的功能,该试验对龙眼基因组数据提取的DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4基因序列进行启动子顺式作用元件及其受miRNA调控的分析;并以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究了DlDCLs不同基因成员在非生物胁迫和外源激素处理下的表达情况。结果显示:(1)龙眼DCL基因启动子中除了TATA和CAAT外,还具有大量的光反应元件、激素应答元件、胁迫响应元件、组织特异性调控元件及植物生长发育相关的顺式调控元件,提示龙眼DCL基因启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导。(2)对调控龙眼DCL基因的miRNA进行筛选,结果显示DlDCL1受miR162和miR1024调控,DlDCL4受miR390和miR396调控。(3)实时荧光定量PCR显示,在一定浓度范围内,外源激素GA3、ABA和ETH均能下调DlDCLs基因的表达,而高浓度ETH处理则显著上调DlDCLs的表达。(4)高浓度蔗糖(6%)处理时DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4显著上调表达,而低浓度(0.1%)处理时DlDCL1显著上调表达;不同温度处理下,DlDCL1在34℃时显著上升,DlDCL3随着温度的提高相对表达量逐渐减低;而DlDCL2和DlDCL4表达量差异不明显;NaCl胁迫处理下,DlDCLs在1h处理时表达量下调,但在其他不同时间点则上调表达。研究表明,龙眼DCL基因在外源激素及非生物胁迫处理下,并非是简单的一对一响应,而是存在较为复杂的响应机制。     

miRNA在异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥厚中的表达及生物信息学分析*

目的:探讨miRNAs(miR199a-5P、miR206、miR133a-3P、miR499-5P)在异丙肾上腺素(ISO)诱导大鼠心肌肥厚模型组中的表达变化;并运用生物信息学方法分析相关的主要信号通路及分子机制。方法:将16只SD雄性大鼠随机分为2组:对照组和ISO模型组,模型组给予ISO(1 mg/kg)诱导心肌肥厚模型,对照组给予等量生理盐水,均采用背部皮下多点注射。连续给药10 d后采用超声心动图测量舒张期室间隔厚度(IVSd)、舒张期左室后壁厚度(LVPWd)、左室舒张末期内径(LVDd)及心脏收缩功能(EF%);称量心脏重量(HW)、大鼠体重(BW),并计算心脏/体重比(HW/BW);心肌组织HE染色,Image J分析软件测量心肌细胞表面积;RT-qPCR检测大鼠心肌组织中4种miRNAs的表达情况。运用Targetscan、miRDB、miRwalk 数据库预测大鼠4种miRNAs可能的靶基因,FunRich软件分析预测靶基因相关的信号通路。结果:与正常组相比,模型组IVSd、LVPWd增厚,LV增大,EF%明显降低;HW、HW/BW增加;模型组心肌细胞体积明显增大,排列紊乱,细胞表面积增加;模型组miR199a-5P、miR206表达上调(P＜0.05);miR133a-3P、miR499-5P表达下调(P＜0.05)。应用生物信息学预测4种miRNAs的靶基因可能参与心肌肥厚相关的信号通路主要有:VEGF/VEGFR信号通路、ErbB受体信号通路等。结论:ISO诱导心肌肥厚导致miRNAs表达的改变,生物信息学预测4种miRNAs参与心肌肥厚相关的靶基因及其主要信号通路,这些研究为心肌肥厚的调控机制及其防治措施提供了新思路。     

文心兰25条miRNA前体序列特性及其表达分析

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre miRNAs在文心兰不同组织部位及软腐病侵染的假鳞茎中的表达情况进行实时荧光定量分析。结果显示：（1）文心兰25条pre miRNAs序列可分为13个家族,其中包含15条成熟体序列。（2）Mfold二级结构预测显示,文心兰25条pre miRNAs的最小折叠自由能在-32.04~ -120.98 kal/mol之间,均可以形成典型、稳定的发夹结构。（3）序列比对分析发现,同一家族的前体与成熟体存在一个约20个碱基长度的保守区域,推测该区域可能为文心兰miRNA成熟体所在区域。其中,13个前体家族中,有10个家族的成熟体可以完全定位于其前体中。（4）实时荧光定量PCR结果显示,在文心兰不同组织部位中,miR159 unigene0037857、miR167 unigene0011236、miR167 unigene0002619、miR169 unigene0022341、miR172 unigene006514、miR396 unigene19032、miR398 unigene0009996、miR2950 unigene0006151、miR2950 unigene0006422等pre miRNAs在叶片中大量累积可能有利于其叶的形态建成;miR162 unigene0003615、miR162 unigene0013441、miR166 unigene0011870、miR168 unigene0009958等pre miRNAs同时在根和叶中均大量表达有利于其根和叶的发育;而miR171 unigene0045985、miR396 unigene0011179、miR396 unigene0011180在根和茎中的大量表达可能有利于其根和茎的发育。（5）在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎的过程中,miR159 unigene0037857、miR167 unigene0011236、miR396 unigene0011179、miR396 unigene0011180、miR396 unigene0019032、miR845 unigene0012489的表达总体呈下降趋势;miR162 unigene0040566、miR166 unigene0011870、miR168 unigene0009958、miR171 unigene0045985在软腐病菌液侵染4 h其表达量升高,之后表达量下调;miR162 unigene0003615、miR167 unigene0002619、miR168 unigene0047942、miR169 unigene0022341、miR845 unigene0012489在菌液侵染过程中其表达量呈现先下降后上升的趋势,并在侵染8 h后表达量达到最低。研究表明,文心兰pre miRNAs 13个家族不同成员在进化进程中具有高度保守性与特异性的结构特点,并可能广泛参与文心兰不同组织的生长发育及参与软腐病菌侵染的响应。     

甜杨低温响应microRNAs的克隆与分析

MicroRNAs (miRNAs)作为一类21碱基左右的非编码小RNAs,参与植物生长发育的调控,并在植物对生物与非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用.本研究依据miRNA高度保守特点,利用已公布的毛果杨(Populus trichocarpa)基因组序列设计引物,从甜杨(Populus suaveolens)基因组中克隆获得了12个miRNA基因座序列.序列比对结果表明,这些miRNA基因均为毛果杨低温响应miRNA基因的同源序列.同时,以低温(0℃)处理0～48 h的甜杨幼苗为试材,通过半定量RT-PCR法对miRNA基因的成熟体序列在不同处理时间下的表达谱进行分析,结果显示,大多数miRNA成熟体序列在甜杨低温胁迫下的表达模式与其在毛果杨中的表达极为相似,由此可推测这些保守性miRNAs可能在甜杨和毛果杨两物种对低温胁迫的应答反应中发挥相似的功能,而miR168a、miR168b和miR475a在两物种间表达现象的差异,表明它们可能通过调控多种靶基因而发挥不同作用.本文结果将为进一步研究甜杨基因功能提供基础.     

芥蓝miR156a家族进化特性及表达分析

miRNA广泛参与植物的发育过程。芥蓝形态多样,叶片发育因品种而异。为了解miR156a家族的进化特性及其在芥蓝叶片发育中的表达模式。该研究对芥蓝miR156a成员及其前体pre miR156a成员进行生物信息学分析,比较不同品种芥蓝叶形的差异,并采用qRT PCR方法分析芥蓝不同组织部位中pre miR156a的表达水平、以及叶形相似的芥蓝品种‘翠宝’和‘改良香菇’中不同类型叶片的pre miR156a成员及其靶基因的表达水平。结果表明：(1)多序列比对和进化树分析发现芥蓝miR156a家族成员和pre miR156a 3p_1在进化过程中高度保守;二级结构预测发现pre miR156a每个成员均能形成茎环结构并包含2～3个miR156a成员序列;靶基因预测显示miR156a 5p和miR156a主要靶向SPL,而miR156a 3p_1则靶向CTPS等不同的基因。(2)‘翠宝’和‘改良香菇’芥蓝的叶形最为相似,qRT PCR分析显示,pre miR156a在‘翠宝’营养生长期的叶片中高度表达。(3)pre miR156a成员在‘翠宝’和‘改良香菇’不同类型叶片中差异表达,pre miR156a主要在成熟叶和菇叶中表达,而pre miR156a 3p_1和pre miR156a 5p在第一片真叶中表达量更高。(4)靶基因分析的结果在不同品种中呈现不同趋势,‘翠宝’成熟叶中SPL10/15高表达,SPL2表达量降低;‘改良香菇’中SPL10在成熟叶和菇叶中表达降低,SPL15在菇叶中高表达,SPL2在不同类型叶片中表达无差异。研究认为,miR156a成员及其靶基因SPL2/10/15可能参与调控芥蓝叶片发育,不同品种中作用的靶基因可能存在差异,从而导致了各品种芥蓝叶片发育的差异。     

玉米microRNAs及其靶基因的生物信息学预测

microRNAs (miRNAs) 是一类非编码的小分子RNA, 通过碱基互补调控靶基因的表达。鉴定和发现新的miRNAs及其靶基因, 对揭示miRNAs在基因表达调控中的作用至关重要。玉米全基因组测序工作开展较晚, 已经鉴定登记的miRNAs很少, 对靶基因的调控作用尚待解明。文章根据miRNA进化上的保守性, 以已知的植物miRNAs为探针, 与相关数据库中玉米表达序列标签(EST)和基因组序列(GSS)中的非编码序列比对, 共发现11个新的miRNA前体。虽然在序列长度和二级结构方面各有变化, 但这11个前体均可折叠形成miRNA家族的标准二级结构。通过靶基因预测, 找到其中7条miRNAs的26个靶基因, 分别编码与新陈代谢、信号转导、转录调节、跨膜运输、生物和非生物胁迫及叶绿体组装等相关的蛋白。这些miRNAs及其靶基因的鉴定, 补充了miRNA数据库的不足。     

基于EST和GSS序列的玉米未知微RNA的数据挖掘

miRNAs通过与靶基因互补位点配对结合,在转录后水平负性调控靶基因的表达.根据miRNA进化上的保守性,以拟南芥、水稻等已知的植物miRNAs为探针,与相关数据库中玉米表达序列标签(EST)和基因组序列(GSS)中的非编码序列比对,采用一系列的标准进行筛选,最后预测得到24个玉米miRNA前体,通过靶基因的预测共得到61个靶基因.通过生物信息学方法大大提高了人们发现miRNAs及其靶基因的效率,补充了玉米miRNA数据库的不足.     

茄子microRNAs与其靶基因的生物信息学预测

microRNAs(miRNAs)是一类在真核生物中发现的长度为21 nt左右、非编码、内源性的单链小分子RNA,通过与靶基因的互补发挥转录后水平的负调控作用。目前,已在许多物种中报道了miRNAs的存在,然而还未见关于茄子miRNAs的报道。根据miRNAs在植物中的高度保守性及其前体的二级结构特征,文章通过同源预测的方法,将已知植物的miRNAs与茄子EST数据库比对,经过一系列的筛选,最终预测到12个家族的16条茄子miRNAs,其中包括3个miRNA家族的正义/反义miRNAs,而miR390和miR399家族的正义/反义miRNAs属于第一次发现。文章还通过在线软件psRNATarget预测到15条茄子miRNAs的71个靶基因,这些靶基因主要编码与茄子生长发育、新陈代谢以及胁迫响应等过程相关的蛋白。     

miR373和miR542-5p调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。为了揭示miRNAs是否参与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的感染与复制,研究了miRNAs对EV71病毒在宿主细胞内复制的影响。构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。实验发现EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件预测并验证可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。为了研究miRNAs分子对5′-UTR基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics,利用Western blotting和real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。实验结果表明,miR373和miR542-5p可以通过作用于EV71病毒5′-UTR基因从而抑制病毒在RD细胞中的复制和表达。细胞内miR373和miR542-5p可以调控EV71在宿主细胞中的复制过程。研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

MiR‐139‐5p,miR‐940 and miR‐193a‐5p inhibit the growth of hepatocellular carcinoma by targeting SPOCK1

The study was aimed to screen out miRNAs with differential expression in hepatocellular carcinoma (HCC), and to explore the influence of the expressions of these miRNAs and their target gene on HCC cell proliferation, invasion and apoptosis. MiRNAs with differential expression in HCC were screened out by microarray analysis. The common target gene of these miRNAs (miR‐139‐5p, miR‐940 and miR‐193a‐5p) was screened out by analysing the target genes profile (acquired from Targetscan) of the three miRNAs. Expression levels of miRNAs and SPOCK1 were determined by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT‐PCR). The target relationships were verified by dual luciferase reporter gene assay and RNA pull‐down assay. Through 3‐(4,5‐dimethyl‐2‐thiazolyl)‐2,5‐diphenyl‐2‐H‐tetrazolium bromide,thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) and transwell assays and flow cytometry, HCC cell viability, invasion and apoptosis were determined. In vivo experiment was conducted in nude mice to investigate the influence of three miRNAs on tumour growth. Down‐regulation of miR‐139‐5p, miR‐940 and miR‐193a‐5p was found in HCC. Overexpression of these miRNAs suppressed HCC cell viability and invasion, promoted apoptosis and inhibited tumour growth. SPOCK1, the common target gene of miR‐139‐5p, miR‐940 and miR‐193a‐5p, was overexpressed in HCC. SPOCK1 overexpression promoted proliferation and invasion, and restrained apoptosis of HCC cells. MiR‐139‐5p, miR‐940 and miR‐193a‐5p inhibited HCC development through targeting SPOCK1.     

miR396基因家族的进化及功能分析

MicroRNA(miRNA)是由约22个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA,广泛存在于真核细胞中,通过与靶基因的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。本文通过对目前miRBase中收录的miR396家族进行生物信息学分析发现,该家族在植物界中高度保守,它们可能起源于较为古老的物种,经历长期复杂的进化过程而保留了下来;靶基因预测结果显示生长调控因子GRF为其主要靶标;启动子分析表明, miR396编码基因的上游存在光、温度、激素、厌氧、干旱及病害等胁迫响应相关的顺式作用元件,它们可与转录因子结合,参与多种胁迫应答反应。本文可为全面深入研究miRNA的作用机制奠定基础。     

Identification and validation of Asteraceae miRNAs by the expressed sequence tag analysis

MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that play a vital role in the regulation of gene expression. Despite their identification in hundreds of plant species, few miRNAs have been identified in the Asteraceae, a large family that comprises approximately one tenth of all flowering plants. In this study, we used the expressed sequence tag (EST) analysis to identify potential conserved miRNAs and their putative target genes in the Asteraceae. We applied quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) to confirm the expression of eight potential miRNAs in Carthamus tinctorius and Helianthus annuus. We also performed qRT-PCR analysis to investigate the differential expression pattern of five newly identified miRNAs during five different cotyledon growth stages in safflower. Using these methods, we successfully identified and characterized 151 potentially conserved miRNAs, belonging to 26 miRNA families, in 11 genus of Asteraceae. EST analysis predicted that the newly identified conserved Asteraceae miRNAs target 130 total protein-coding ESTs in sunflower and safflower, as well as 433 additional target genes in other plant species. We experimentally confirmed the existence of seven predicted miRNAs, (miR156, miR159, miR160, miR162, miR166, miR396, and miR398) in safflower and sunflower seedlings. We also observed that five out of eight miRNAs are differentially expressed during cotyledon development. Our results indicate that miRNAs may be involved in the regulation of gene expression during seed germination and the formation of the cotyledons in the Asteraceae. The findings of this study might ultimately help in the understanding of miRNA-mediated gene regulation in important crop species.     

A role for the miR396/GRF network in specification of organ type during flower development,as supported by ectopic expression of Populus trichocarpa miR396c in transgenic tobacco

The MIR396 family, composed of ath‐miR396a and ath‐miR396b in Arabidopsis, is conserved among plant species and is known to target the Growth‐Regulating Factor (GRF) gene family. ath‐miR396 overexpressors or grf mutants are characterised by small and narrow leaves and show embryogenic defects such as cotyledon fusion. Heterologous expression of ath‐miR396a has been reported in tobacco and resulted in reduction of the expression of three NtGRF genes. In this study, the precursor of the Populus trichocarpa ptc‐miR396c, with a mature sequence identical to ath‐miR396b, was expressed under control of the CaMV35S promoter in tobacco. Typical phenotypes of GRF down‐regulation were observed, including cotyledon fusion and lack of shoot apical meristem (SAM). At later stage of growth, transgenic plants had delayed development and altered specification of organ type during flower development. The third and fourth whorls of floral organs were modified into stigmatoid anthers and fasciated carpels, respectively. Several NtGRF genes containing a miR396 binding site were found to be down‐regulated, and the cleavage of their corresponding mRNA at the miR396 binding site was confirmed for two of them using RACE‐PCR analysis. The data obtained agree with the functional conservation of the miR396 family in plants and suggest a role for the miR396/GRF network in determination of floral organ specification.