巴西固氮螺菌中PⅡ和Pz在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)中,glnB和glnZ是两个高度同源基因,分别位于3.7kb/EcoRI+PstI和3.7kb/SalI的两个不同的染色体片段上.用卡那霉素盒(Kmr-cas-sette)插入法,对glnB和glnZ分别进行定位诱变,并获得相应的突变株,即glnB-和glnZ-.研究表明,glnB-突变株丧失固氮酶活性,表现为Nif-,而glnZ-象野生型菌株一样具有固氮酶活性.为了进一步研究这两个基因的功能,将glnB和glnZ分别构建在pVK100载体上形成重组质粒pVK-Ⅱ和pVK-Z,对glnB-和glnZ突变株进行互补实验,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性,而glnZ无此作用.同时,通过三亲接合法将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT-突变株中,使glnB和glnZ的拷贝数增加,进一步比较它们的固氮酶活性.结果表明多拷贝的glnB基因,能显著提高固氮酶活性,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响.同时,将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到nifA-突变株中,结果表明glnB和glnZ均不能恢复nifA-的固氮酶活性.     

巴西固氮螺菌中PⅡ和Pz在固氮调节中的不同使用

在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)中,glnB和glnZ是两个高度同源基因,分别位于3.7kgb/EcoRI PstI和3.7kb/SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒（Km^r-cas-sette)插入法,对glnB和glnZ分别进行定位诱变,并获得相应的突变株,即glnB^-和glnZ^-。研究表明,glnB^-突变株丧失固氮酶活性,表现为Nif^-,glnZ^-象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能,将glnB和glnZ分别构建在pVK100载体上形成重组质粒pVK-Ⅱ和pVK-Z,对glnB^-和glnZ^-突变株进行互补实验,进一步证明了glnB与固氮酶活直接相关性,而glnZ无此作用。同时,通过三亲接合法将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT^-突变株中,使glnB和glnZ的拷贝数增加,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因,能显著提高固氮酶活性,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时,将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到nifA^-突变株中,结果表明glnB和glnZ均不能恢复nifA^-的固氮酶活性。     

巴西固氮螺菌Yu62glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中,筛选到glnB基因的阳性克隆,将3.7kb/EcoRI PstI的阳性克隆亚克隆到pUC19中,进行了全序列分析,其在GenBank中的登记号是AF323960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶（GS）的glnA基因,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长336bp,编码112个氨基酸,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达71%、77%、79%和69%。将卡那霉素抗性片段（Km-cassette)插入glnB基因的BglII位点,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中,通过同源重组,获得GlnB^-突变株（glnB::Km）。为进一步分析glnB基因的功能,将glnB基因的编码区（339bp）构建在pVK100中,置于Km启动子下组成型表达,形成重组质粒pVK-II。将重组质粒pVK-II转入到GlnB^-突变株,构建成互补株C-glnB(glnB:Km/glnB)。对GlnB^-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明,GlnB^-突变体无固氮酶活性,即表型为Nif^-;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK-II分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT^-突变标中,使glnB基因的拷贝数增加,并进一步比较它们的固氮酶活性,结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性。     

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析*

用卡那霉素盒(Kmr-cassette)插入法,对巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的draTG基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株。研究表明：draT变突株的固氨酶活性不再受铵抑制,而draG突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。draTG下游区域突变株YZ4(突变位点距draG约2kb)在无氮及限铵条件下,其固氮酶活性比野生型菌株的高,但其nifH-lacZ转录融合子的表达并不受影响,说明该区域可能有参与固氮酶活性水平调控的基因。     

肺炎克氏杆菌的nifA基因产物在巴西固氮螺菌中的功效

通过三亲本杂交将质粒pCK3{携带改变了启动子的肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneuma-niae)nifA 基因]引入巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62菌株中,由此获得的转移接合子巴西固氮螺菌Yu62-4菌株在6．0 mmol/L以上NH+4浓度下,能表现出微弱的固氮酶活性(相当于无NH+4时活性的0．3-0．5％),而野生型Yu62则全部丧失固氮酶活性。固氯酶的丙烯酰胺凝胶电泳和铁蛋白的免疫杂交实验表明,转移接合子Yu62-4在高NH+4(50mmol／L)下,虽有铁蛋白合成,但合成量比无NH+4时少得多,而且有一部分铁蛋白未被共价修饰;野生型菌株Yu62在此NH+4浓度下无铁蛋白合成。实验结果表明：外源(来自肺炎克氏杆菌)的基因产物在巴西固氮螺菌Yu62中不能有效地解除NH+4对该菌固氮酶合成的阻遏作用。本文分析了出现这种现象的原因。     

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析

用卡那霉素盒（Ｋｍ－ｃａｓｓｅｔｔｅ）插入法,对巴西固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）Ｙｕ６２的ｄｒａＴＧ基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株,研究表明ｄｒａＴ变突株的固氮酶活性不再受铵抑制,而ｄｒａＧ突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能使像野生型菌株那样恢复活性,ｄｒａＴＧ下游区域突变株ＹＺ４（突变位点距ｄｒａＧ约２ｋｂ）在无氮及限铵条件下,其固氮酶     

巴西固氮螺菌ntrBC基因的克隆与核苷酸序列分析

以EMBL3为载体,构建了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的基因文库.以巴西固氮螺菌Yu62中PCR扩增出的450bp DNA 片断作为探针,对该基因文库进行筛选,得到了10个阳性克隆(EA1—EA10),其中含有两种不同类型的克隆,分别以EA4和EA9为代表.对EA4的杂交分析发现目的基因位于2.9kb EcoRI片段上.DNA序列分析结果表明该片段含有完整的ntrC编码区,其编码产物由480个氨基酸组成.分子量为53469;ntrC上游是完整的ntrB编码区,其编码产物由400个氨基酸组成,分子量为43487.对相应的NtrC和NtrB氨基酸序列进行同源性分析,说明巴西固氮螺菌与根瘤菌的亲缘关系较与其它自生固氮菌的更为接近.     

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植

将GFPmut2质粒中的gfp基因(编码绿色荧光蛋白)克隆到载体pVK100中,构建成重组质粒pVK1001。将pVK1001通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu62中,获得GFP)标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株。用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米(农大3318)幼苗,在接种后8d、12d,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测,结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙。用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明,大多数细菌主要定植于根表,少数菌可进入玉米根组织内。     

巴西固氮螺菌Yu62在玉米根的定植

将GFPmut2质粒中的gfp基因 (编码绿色荧光蛋白)克隆到载体pVK100中,构建成重组质粒pVK1001.将pVK1001通过电转化方法导入到联合固氮菌巴西固氮螺菌Yu62中,获得GFP标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株.用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米(农大3318)幼苗,在接种后8 d、12 d,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测,结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株能定植于玉米根部皮层的薄壁细胞间隙.用扫描电镜和超薄切片电镜观察表明,大多数细菌主要定植于根表,少数菌可进入玉米根组织内.     

固氮螺菌氢代谢与固氮作用的关系III．转座子Tn5诱变的 Azospirillum brasilense 吸氢活性缺陷株的筛选

以携带有自杀性质粒pR64：：Tn5的大肠杆菌(E．Coil RL29)为供体菌株,与受体菌巴西固氮螺菌W251-10(Azospirillura brasilense W251-10)进行杂交,在选择性平板上测得卡那霉素抗性菌落与受体菌菌落之比为5．0x 10-7。受体菌W251-10的卡那霉素抗性自发突变频率小于1.14×10-9。经气相色谱仪分析测得一株丧失吸氢酶(Hydrogen Uptake Hydrogenase)活性的突变株(编号为 Azospin llum brasilense WG15),同时发现其固氮酶(Nitrogenase)话性也已丧失。 DNA分子点杂交结果表明,所获得的突变株WGl5的总DNA中存在有’n5的序列,而w251—10呈阴性结果,从而证实了WGl5吸氢活性的丧失是由于Tn5在DNA中的插入引起的,同时也揭示了巴西固氯螺菌的吸氢酶基因(缸p)和固氮基因(nr,) 在遗传学上有着连锁的关系。     

DNA聚合酶X家族的起源与进化分析

随着DNA聚合酶X家族成员数量的增加,家族内部的系统发育需要重新检查。来自病毒和细胞的DNA聚合酶X家族成员序列第一次被汇编在一起,进行系统发育分析。分析显示：真核生物DNA聚合酶bcta(polβ)是这个家族的祖先基因,可能与昆虫痘病毒(EPv)之间发生过基因的水平转移;DNA聚合酶mu(polμ)基因仅存在于哺乳动物基因组中,是脱氧核苦酸末端转移酶(TdT)的重复基因;这个家族在低等真核生物的种系进化过程中发生了基因丢失。     

基因组结构信息在动物系统发育研究中的应用

随着人类基因组和一些模式生物、重要经济生物以及大量微生物基因组测序的完成,生物学整体研究业已进入基因组时代.最近5～10年以来,利用基因组结构信息进行系统发育推断的研究形成了分类学和进化生物学中的前沿领域之一.相对于核苷酸或氨基酸序列中的突变而言,基因组的结构变化--内含子的插入/缺失、反转录子的整合、签名序列、基因重复以及基因排序等--是更大空间(或者时间空间)尺度上的相对稀缺的系统发育信息,一般用于科和科以上阶元间的亲缘关系研究.基因组全序列的获得和其中各基因位置的确定有利于将基因组中不同层次的系统发育信息综合起来,利用全面分子证据(total molecular evidence;包括基因组信息,DNA、RNA、蛋白质的序列信息,RNA和蛋白质的高级结构等)进行分子系统学研究.     

冰核微生物中冰核基因重复序列PCR分析

在本试验的条件下,Pseudomonoas svringae inaZ基因产生的蛋白的主要重复基元的编码区：5’－GCCGGTTATGGCAGCACGCTGACC－3’序列既在冰核真菌、细菌中存在,也在非冰核真菌、细菌中存在,即冰核细菌、真菌和非冰核细菌、真菌都有扩增产物,并且产物呈多态性,同一个种不同菌株间也呈多态性,说明该引物不适合用于鉴定真菌、细菌中冰核基因是否存在,也不能用于区分冰核真菌和非冰核真菌以及分区冰核细菌和非冰核细菌,更不能根据其扩增片段的量和大小说明冰核真菌、细菌冰核活性的强弱。     

植物低温诱导蛋白和低温诱导基因的表达调控

对于温带作物而言,耐冷是一种重要的农艺性状,它对作物的安全越冬和生存起决定作用。阐明冷驯化的形成机理无疑对提高作物的耐冻性使之免遭冰冻伤害具重要意义。自从1906年Wiegand提出研究冻害机制的重要性以来,已经发表了数以千计的文章来探讨低温胁迫对植物形态结构和生理     

运用生色基因标记黄瓜根围促生菌(PGPR)筛选菌株

采用三亲交配方法 ,通过Tn7转座系统将lacZY标记基因导入黄瓜根围促生菌 (PG PR)筛选菌株PseudomonasfluorescensCN1 1 6和PseudomonascorrugataCN31的利福平抗性突变株中 ;标记假单胞菌菌株则被赋予了利用乳糖作为唯一碳源的能力 ,在只有乳糖的M9培养基上生长能分解X Gal,菌落显出特有的蓝色 ;经Southern杂交分析 ,证明标记基因lacZY存在于转化菌株的染色体上 ;经验证标记菌株标记性状稳定 ,与对应的野生菌株比较其它性状如培养性状、形态特征、生防效果等基本不变 ;PGPR菌株利福平抗性和生色基因标记的结合 (双标记 )能最大限度地将土壤中引入的PGPR菌株与土著细菌分开 ,检测下限可达 1 0CFU mL ,为PGPR在根围的分子生态学研究提供了一个较好的工具。     

苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探

苎麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSaw．）可分泌具有诱抗作用的激发蛋白（α－elicihn）,根据α－elicitin第24～30和56～63位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组DNA进行特异PCR扩增反应,发现其扩增的DNA片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增DNA,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的elicihn基因亚克隆DNA为570hp,大于预计的117bp。在特异片段中,存在3个内含子将基因断裂成4个阅读框架,即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4,其中ORF1和ORF4含有与引物相同的序列,但与其它序列与已克隆的elicihn基因无同源性。因此,芒麻疫霉基因组中的elicitin基因可能存在断裂现象。     

蜘蛛杀虫肽基因的合成及其在植物中表达质粒的构建

近年来用生物制剂防治害虫,虽然可以避免环境污染,但效果往往不稳定,而用基因工程方法,将抗虫基因导入植物的基因组中,让植物自身产生抗虫物质,将是一种理想的途径［１,２］。抗虫的植物基因工程主要是利用苏云金杆菌的内毒素蛋白,转化此基因的烟草和番茄显示了对虫的抗性［３—６］。澳大利亚Ｄｅａｋｉｎ大学从一种蜘蛛毒液中分离纯化到一种只有３７个氨基酸的小肽,体外实验发现其能杀死多种对农业生产有害的昆虫,但对哺乳动物没有毒害作用［７］。我们根据此肽的氨基酸序列,采用植物偏爱的密码子,人工合成并克隆了此肽的基因…     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

THE COEVOLUTIONARY IMPLICATIONS OF HOST TOLERANCE

Host tolerance to infectious disease, whereby hosts do not directly “fight” parasites but instead ameliorate the damage caused, is an important defense mechanism in both plants and animals. Because tolerance to parasite virulence may lead to higher prevalence of disease in a population, evolutionary theory tells us that while the spread of resistance genes will result in negative frequency dependence and the potential for diversification, the evolution of tolerance is instead likely to result in fixation. However, our understanding of the broader implications of tolerance is limited by a lack of fully coevolutionary theory. Here we examine the coevolution of tolerance across a comprehensive range of classic coevolutionary host–parasite frameworks, including equivalents of gene‐for‐gene and matching allele and evolutionary invasion models. Our models show that the coevolution of host tolerance and parasite virulence does not lead to the generation and maintenance of diversity through either static polymorphisms or through “Red‐queen” cycles. Coevolution of tolerance may however lead to multiple stable states leading to sudden shifts in parasite impacts on host health. More broadly, we emphasize that tolerance may change host–parasite interactions from antagonistic to a form of “apparent commensalism,” but may also lead to the evolution of parasites that are highly virulent in nontolerant hosts.     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因