人ABCB6表达载体的构建及稳定表达细胞株A375的筛选

目的构建表达载体pIRES2-ZsGreen1-ABCB6,在转染的人黑素瘤细胞系株A375中筛选其稳定表达的细胞株。方法抽取健康人外周血,分离外周血单个核细胞,提取总RNA,逆转录获取cDNA序列,加入特异性引物经PCR扩增获得ABCB6cDNA双链,再经过BglII、EcoRI双酶切PCR产物及质粒载体pIRES2-ZsGreen1,酶切产物经回收、T4DNA连接酶连接,产物转化到大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆经菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析,以确定构建质粒正确。转染人黑素瘤细胞株A375,G418筛选稳定表达ABCB6的单克隆细胞株,应用荧光显微镜鉴定ABCB6蛋白的表达情况。结果 pIRES2-ZsGreen1-ABCB6质粒经菌落PCR、酶切、测序鉴定正确,经过G418筛选后获得稳定细胞株,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在A375细胞中的表达。结论表达载体pIRES2-ZsGreen1-ABCB6构建正确,并成功筛选出稳定表达ABCB6的A375细胞株,为进一步研究ABCB6的生物学功能奠定了良好基础。     

人胰岛素样生长因子-1真核双顺反子表达载体pIRSES2-EGFP-hIGF-1的构建与鉴定

目的:利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)全长基因的真核表达栽体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并观察其在人胚肾293细胞中的表达.方法:应用PCR方法从人肝细胞文库中提取人hIGF-1全长cDNA序列,克隆入T-pMD18载体中,经测序证实序列正确后,利用XhoI/EcoRI进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR进行鉴定证实插入片段的正确性.应用高效转染试剂X-treme GENE HP DNA Transfection reagent介导真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1转染人胚肾细胞(HEK293),转染后利用倒置荧光显微镜与RT-PCR观察目的基因在靶细胞中的表达.结果:经酶切和测序证实重组质粒栽体构建正确,转染后48小时可观察到绿色荧光的表达,RT-PCR结果证实转染pIRES2-EGFP-hIGF-1后可有hIGF-1基因靶细胞中表达.结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,目的基因与标记基因可同时在靶细胞中表达,为后续研究奠定基础.     

2A肽介导猪PID1与CuZnSOD双基因真核共表达载体的构建与细胞表达

构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒转染至PK15细胞,细胞内荧光显微镜下观察其荧光的表达,RT-PCR、Westernblot技术分别检测PID1基因与CuZnSOD基因mRNA和蛋白表达情况。重组克隆载体插入目的片段序列与PID1基因与CuZnSOD基因序列完全一致。PIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体测序、酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察转染后的PK15细胞出现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组（P〈0.05）。Westernblot检测结果表明pIRES2-CuZnSODPID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1的构建及鉴定

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因Nurr1的真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1,并检测其在293T细胞中的表达。方法:采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从大鼠黑质中获取Nurrl基因,连接T载体测序正确后与真核空载体pIRES2-EGFP一起,经Nhe1和Xho1双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pIRES2-EGFP-Nurr1;真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1测序正确后采用脂质体法将其转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观察转染效率,PCR检测Nurr1基因mRNA水平的表达情况,免疫印迹试验(Western Blot)检测Nurr1蛋白的表达水平。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1;293T细胞转染pIRES2-EGFP-Nurr1后可以高度表达绿色荧光,有效转录Nurr1基因并正确的高表达Nurr1蛋白。结论:成功构建Nurr1真核表达载体且在293T细胞中高水平表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),基因治疗帕金森病奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)合成酶Rv3586结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法:以Mtb基因组为模板PCR扩增Rv3586三个结构域基因,分别克隆入pEGFP-N3真核表达质粒,用菌落PCR、质粒酶切和测序方法对插入序列进行鉴定。通过脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因在COS-7细胞内的表达。结果:PCR成功扩增出Rv3586三个结构域基因,菌落PCR、质粒酶切和质粒测序鉴定结果表明成功插入目的片段,包含Rv3586的三个结构域基因的真核表达载体构建成功。间接免疫荧光法结果显示,Rv3586三个结构域蛋白在COS-7细胞中表达成功。结论:成功构建Rv3586三个结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达成功,为后续Mtb Rv3586结构域的功能和应用研究奠定了基础。     

猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定.结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础.     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3 的构建与鉴定

目的:构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法:首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果:酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论:成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的:构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法:利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果:成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论:成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

真核表达质粒pcDNA3.1-CSRP2-HA的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒PcDNA3.1-CSRP2-HA。方法:据GeneBank中人CSRP2 CDS序列设计并合成引物,提取A549细胞总RNA,并将其逆转录成cDNA作为模板,进行PCR扩增,获得CSRP2目的基因后,再与PcDNA3.1-HA载体进行连接重组,构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,经限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测序分析等方法鉴定后,瞬时转染入A549细胞,Western blot法检验CRP2蛋白表达。结果:成功构建PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒,Western-blot结果显示PcDNA3.1-CSRP2-HA能够在A549细胞中表达。结论:PcDNA3.1-CSRP2-HA真核表达质粒构建并鉴定成功,为后续研究CRP2在炎症诱发氧化损伤机制中的转录调控作用奠定了基础。     

大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位

[目的]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞中表达、定位。[方法]应用基因合成方法获得STIM1基因序列,克隆至携带EGFP标签的真核表达载体p EGFP-C_1、p IRES_2-EGFP,经菌落PCR、酶切、测序鉴定后,转染至A7r5细胞,Western Blot检测蛋白表达,激光共聚焦观察其定位。[结果]STIM1全长2 058 bp,重组载体经酶切、PCR、测序鉴定构建正确,在A7r5细胞内高表达,并主要定位于细胞质。[结论]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞质中表达,为建立稳定高表达细胞系及后续功能研究奠定基础。     

双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3的构建与鉴定

目的：构建与鉴定骨形态发生蛋白BMP2和转化生长因子TGFβ3双基因真核表达载体pIRES-BMP2-TGFβ3。方法：首先,用PCR方法从质粒pGEMT/BMP2中扩增出BMP2基因全长,并将其连入双基因真核表达载体pIRES,得到质粒pIRES-BMP2,其次,从人胚胎组织提取总RNA,反转录成cDNA,以反转录的cDNA为模板,PCR扩增出TGFβ3基因全长,将TGFβ3基因连入质粒pIRES-BMP2;用酶切的方法筛选出阳性重组质粒,并进行测序鉴定。结果：酶切鉴定证明已将BMP2和TGFβ3两个基因连入载体中,测序结果完全正确。结论：成功构建PIRES-BMP2/TGFβ3双基因真核表达载体。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及其在A549细胞中的表达

目的:构建人DC-SIGN基因真核表达质粒,观察其在人肺腺癌细胞A549中的表达.为进一步研究DC-SIGN的作用奠定实验基础.方法:用PCR的方法扩增编码DC-SIGN的基因序列,将其克隆到真核表达载体pCDNA中,酶切及测序鉴定重组质粒.将构建的重组质粒转染到A549细胞中,用Western Blotting和免疫荧光等方法检测DC-SIGN基因的表达.结果: 从人cDNA文库中得到1 215bp的DC-SIGN序列后,重组到pCDNA载体中,经酶切及测序鉴定,成功构建pCDNA-DC-SIGN重组质粒.重组质粒转染A549细胞,经Western blotting检测,发现在约55kDa处有特异条带,与理论大小相符.应用免疫荧光技术检测DC-SIGN可在A549细胞内的表达.荧光显示Myf5蛋白定位在细胞浆中.建立表达DC-SIGN的细胞株.结论:成功构建了人DC-SIGN的真核表达载体,并建立了人DC-SIGN的真核表达细胞株.     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

小鼠DLL1真核表达载体的构建及其在肿瘤细胞中的表达

目的：构建带绿色荧光蛋白的小鼠DLL1全长基因真核表达载体,并在肿瘤细胞中表达。方法：利用PCR特异性引物扩增出DLL1基因全长,将克隆的基因片段插入带绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP质粒中。然后利用脂质体将重组质粒pIRES2-EGFP-DLL1转染进小鼠B16黑色素瘤细胞中,并通过G418筛选后选取生长良好、荧光强度高的三株单克隆进行mRNA水平DLL1表达的鉴定。结果：成功扩增小鼠DLL1的全长基因。克隆入质粒载体后,通过DNA序列测定证实其序列正确。将构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒转染小鼠B16黑色素瘤细胞,经过G418筛选和荧光显微镜观察后,挑选得到GFP阳性率90%以上的稳定转染细胞株。RT-PCR检测稳定转染细胞的mDLL1的表达显著增加,进一步证实了pIRES2-EGFP-DLL1的表达效能。结论：成功构建了小鼠DLL1基因的真核表达质粒,证实其在真核细胞B16中可以表达。     

大鼠PLCG2基因的pHBAd-MCMV-GFP真核表达载体构建及鉴定

[目的]构建大鼠PLCG2(rPLCG2)的pHBAd-MCMV-GFP真核重组质粒,为进一步构建rPLCG2高表达腺病毒载体奠定基础。[方法]以合成的rPLCG2-pUC57质粒为模板,PCR扩增获得r PLCG2基因,并克隆至真核表达载体pHBAd-MCMV-GFP中。转化DH5α感受态,菌液PCR阳性克隆鉴定,并对阳性样本进行测序。[结果]成功构建了真核重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-rPLCG2。[结论]pHBAd-MCMV-GFP-rPLCG2真核表达载体的成功构建为后续rPLCG2高表达腺病毒载体的构建及其功能的研究奠定基础。     

CDH17/pcDNA3.1(-)真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建肝肠钙黏连蛋白(CDH17)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究胃癌发病的分子机制和生物学行为以及寻找新的抗转移措施奠定理论基础。方法:用Trizol Reagent抽提胃腺癌组织中总RNA,采用逆转录巢式PCR方法扩增CDH17目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1(-),再将CDH17基因片断插入pcDNA3.1(-)线性质粒,即构建成CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒,将质粒转染感受态细胞DH5a,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论:CDH17/pcDNA3.1(-)真核细胞表达质粒构建成功。     

Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。     

人尿激酶型纤溶酶原激活因子截短型突变体与绿色荧光蛋白在真核细胞HEK293F中的融合表达

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)截短型突变体与绿色荧光蛋白(EGFP)分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达。方法:采用PCR法,分别以质粒pIRES2-EGFP和重组质粒pcDNA3.1(+)/uPA为模板,扩增出带BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EGFP及带NheⅠ和HindⅢ酶切位点的uPA截短体基因片段,先后将EGFP和截短型uPA基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,转入HEK293F细胞,用G418对转染细胞进行加压筛选,通过共聚焦显微镜观察和ELISA方法鉴定表达产物。结果:DNA测序结果显示,uPA不同截短型突变体基因片段与EGFP基因融合的真核表达载体构建成功,共聚焦显微镜观察发现HEK293F细胞中有绿色荧光且定位于细胞质中,ELISA检测到HEK293F细胞培养上清中分泌型融合蛋白的表达。结论:构建了uPA截短型突变体与EGFP分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达,为后期研究uPA的相互作用蛋白及其生理功能奠定了基础。