裸燕麦AFLP反应体系的优化

影响裸燕麦AFLP反应的关键因素包括基因组DNA提取过程中氯仿-异戊醇的抽提次数,酶切时间,预扩增产物稀释倍数,选择性扩增中Mg2+、dNTP、引物浓度等.本研究对这些影响因素进行了优化,初步建立了适合裸燕麦的AFLP反应体系.并将该体系应用于引物筛选,在12份材料中,共筛选出20对条带清晰、多态性好的引物组合,为裸燕麦遗传多样性分析提供了基础.     

蜡梅AFLP分子标记技术体系的建立

利用简易CTAB法、改良的CTAB法和SDS法提取蜡梅[Chimonanthus praecox(L.)Link]成熟叶和嫩叶的基因组,并进行了检测比较。结果显示,改良的CTAB法更适合蜡梅基因组DNA的提取,蜡梅叶片的年龄并不影响蜡梅基因组DNA的提取;同时利用AFLP分子标记技术,采用MseI-EcoR I酶切组合,从168对引物中筛选出10对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物,分别为:M23E46、M24E46、M25E46、M23E47、M24E47、M41E47、M41E94、M64E94、M64E66和M24E75,并确定了适用于蜡梅AFLP反应的最佳酶切连接、预扩和选扩体系,从而为今后利用AFLP分子标记技术研究蜡梅的品种分类和野生居群的遗传多样性分析打下坚实的基础。     

日本沼虾AFLP反应体系的建立

目的:建立一个适于日本沼虾研究用的 AFLP 反应体系.方法:以日本沼虾 DNA 为材料,对基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2 、dNTP浓度、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M 3/E 3配比等进行了比较分析.结果:酶切5h,选扩 25ul PCR 反应体系中Mg2 2mmol/L,dNTP 1.2rmnol/L,预扩产物稀释 40 倍,选扩引物M 3/E 3配比为8:1,所得产物在毛细管电泳中可得剑稳定的结果.结论:该体系的构建为 AFLP 技术在日本沼虾相关研究中的应用奠定了基础.     

三例小麦细胞质雄性不育系线粒体DNA的扩增片段长度多态性分析

细胞质雄性不育是小麦杂种优势利用的重要途径,为了鉴定3例小麦雄性不育系的细胞质类型,对其线粒体DNA(mtDNA)进行扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)分析。文中利用差速离心法和不连续蔗糖密度梯度超速离心法提取纯化小麦线粒体。结果表明:通过该提取方法获得的mtDNA,其质量和纯度能够满足PCR反应和遗传学分析。在64对选扩引物中,筛选到了4对特异性引物,其中引物E1/M7在ms(Kots)-90-110不育系扩增出3条特异条带;引物E4/M2在ms(Ven)-90-110不育系扩增出2条特异条带;引物E7/M6在ms(S)-90-110不育系中扩增出2条特异条带;引物E6/M4在ms(Kots)-90-110不育系中扩增出2条特异条带。这些特异引物可以用来作为鉴定具有粘果山羊草Aegilops kotschyi、偏凸山羊草Ae.ventricosa、斯卑尔脱小麦Triticum spelta 3类不育细胞质型小麦雄性不育系的细胞质分子标记,为研究小麦细胞质雄性不育机理奠定了分子基础。     

AFLP标记技术在鉴定甘蓝种子真实性及品种纯度中的应用

利用AFLP方法对在农业生产上大面积推广使用的5个甘蓝杂交组合及其10个亲本共15个材料进行了分析研究,得到了清晰的DNA扩增指纹图谱.在AFLP分析中,共采用了32个EcoRI+3/MseI+3引物组合,每个引物组合扩增出的条带数在43～62条之间,平均为54.5条.并从这32个引物组合中筛选出一个引物组合,能够用来对供试5个甘蓝杂交种进行真实性及品种纯度鉴定.从而证明了AFLP技术在甘蓝种子真实性及品种纯度鉴定中的可行性.该技术应用于甘蓝种子真实性及品种纯度鉴定在国内尚属首次,其稳定性重复性好,检测分辨率高,很适合甘蓝种子真实性及品种纯度鉴定.是今后种子真实性及品种纯度鉴定的发展方向,应加大其研究力度.     

光皮桦AFLP分子标记体系的建立

为了建立光皮桦AFLP分子标记体系,利用SDS法、常规CTAB法和CTAB-硅珠法提取光皮桦(Betula luminifera H.Wink.)嫩叶DNA,并进行检测比较.结果显示,CTAB-硅珠法更适合光皮桦基因组DNA的提取,所得在基因组DNA纯度高OD值在1.8左右,适用于AFLP分析.利用AVLP分子标记技术,采用Mse I-EcoRI酶切组合,从64个引物组合中筛选出51个带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物组合.同时,通过对比实验确定了光皮桦AFLP反应的最佳模板DNA用量为300ng、酶切时间4h和预扩增产物稀释倍数30倍等,优化了相关AFLP反应体系,为今后利用AFLP分子标记技术研究光皮桦野生居群的遗传多样性分析和分子遗传图谱的构建打下坚实的基础.     

南药益智AFLP-PCR体系的建立与优化

[目的]建立适合南药益智的扩增片段长度多态性(AFLP)扩增体系来研究不同地理居群益智遗传多样性。[方法]利用植物基因组试剂盒法提取高质量的益智基因组DNA,采用单因素和正交试验对AFLP过程中的酶切和PCR相关影响因素进行优化,并对适合益智AFLP分析的引物组合进行筛选。[结果]实验结果表明最佳酶切反应体系:模板DNA 0.6μg,酶量20 U,酶切时间2 h;最佳AFLP-PCR选择性扩增反应体系(总体积为25μL):10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL,d NTPs 2μL,Mg2+(25mmol/L)1.5μL,引物(10 pmol/μL)各2.0μL,Taq酶(5 U/ml)0.5μL,模板稀释25倍2μL。利用建立的最佳扩增体系从64对引物中筛选获得8对选择性引物适合益智AFLP分析。[结论]建立了稳定的AFLP-PCR体系,为研究益智遗传多样性的AFLP分析奠定了基础。     

金沙江干热河谷地区构树的AFLP分析

根据构树树皮颜色和斑纹色泽,将金沙江河谷两岸自然分布的构树分为4个不同类型,即红构、红花构、白花构和青构.应用AFLP分子标记技术,采用E 3/M 3引物组合,对该4个类型构树进行了分析鉴定.结果显示,9对引物组合共扩增出584条带,其中237条为多态带,多态带百分率为40.6%;9对引物组合扩增得到了4类构树各自特有的AFLP指纹图谱,并可明确区分4个类型构树;UPGMA聚类分析结果与供试材料的形态鉴别完全一致.结果表明,4个类型构树的表型差异是由遗传物质的变异而引起,从而为构树新品种的划分、鉴定和登录奠定了基础.     

10种冬青属植物遗传多样性RAPD和AFLPs分析

采用RAPD和AFLP技术,对10种冬青属植物基因组进行DNA片段扩增,以研究该属种间遗传多样性.结果表明:在RAPD分析中,通过对100种10个碱基随机引物的筛选,发现11种引物能得到多态性较高扩增产物,11种引物共扩增出301条多态性条带,多态率为98.63%.在AFLP分析中,3对选择性引物组合均扩增出了丰富的多态性片段.利用RAPD和AFLP技术分析,结果按UPGMA类平均法进行聚类,聚类结果显示冬青和代茶冬青,木姜冬青和浙江冬青以及光枝刺缘冬青与毛枝三花冬青之间的亲缘关系最近.     

基于果蝇DNA甲基化的AFLP体系的建立及优化

以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Canton-S品系为材料,采用改良SDS法提取高质量DNA,对连接、预扩增及选择性扩增进行分析,建立适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究的AFLP优化体系:1)10μL连接体系加T4连接酶1 U,AluⅠ接头50 pmol,EcoR Ⅰ接头5 pmol,4℃反应12 h;2)25μL预扩增体系含Mg2+0.2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板1.0μL,Taq DNA聚合酶2 U,E-00 50 ng,A-00 50 ng;3)25μL选择性扩增体系含Mg2+0.1 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板2.0μL,Taq DNA酶1.5 U、E+340 ng,A+3 40 ng.该体系稳定性高、重复性好,适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究.     

用RAPD分析四种无尾类的系统演化关系

利用RAPD技术检测了分属无尾目3个科（雨蛙科、蟾蜍科、蛙科）的黑眶蟾蜍（Bufomelanostictus)、中国雨蛙（Hyla chinensis）、泽陆蛙（Rana limnocharis）、沼水蛙（R.guentheri)的系统发生关系。经19个随机引物对4个物种基因组DNA进行扩增,选择其中扩增谱带清晰的16个引物进行分析,计算不同科间及同一科内不同种间的遗传距离,结果表明：16个引物获得的RAPD谱带均表现出不同程度的多态性;泽陆蛙与沼水蛙间的亲缘关系最近,而黑眶蟾蜍与中国雨蛙之间的亲缘关系较黑眶蟾蜍与蛙科的泽陆蛙、沼水蛙之间以及中国雨蛙与泽陆蛙、沼水蛙之间的亲缘关系近,从基因组DNA水平上也说明雨蛙科与蟾蜍科间的亲缘关系更近,与蛙科的亲缘关系更远,这与形态学、染色体和线粒体DNA多态性研究的分析结果一致,从而进一步从分子水平上为无属目这3科的系统演化提供了新的证据。     

羊草种质基因组DNA的AFLP多态性研究

羊草是禾本科牧草之王 ,在当前我国西部生态建设和草原畜牧业发展中发挥着重要作用。用AFLP方法对2 7份我国不同地区分布的羊草 (Leymuschinensis (Trin .)Tzvel)材料进行了基因组DNA多态性分析 ,8对AFLP引物组合在 2 7个不同羊草基因型中共扩增出 5 37条带 ,产生出的DNA片段大小分布在 75bp - 5 30bp之间。其中单态性带 89条 ,占 16 .6 % ,多态性带 32 9条 ,占 6 1.3%。平均每对引物组合扩增的DNA带数为 6 6 .13,总的多态性比率为 78.84%。AFLP多态信息含量PIC值分布于 0 .0 - 0 .5之间 ,平均PIC值为 0 .2 16 ,出现的PIC最大值 (0 .5 )约占AFLP标记的 8.5 % ,说明羊草基因组DNA的多态性比较丰富。以 5 37个AFLP标记为原始数据 ,根据Nei和Li的方法对 2 7份羊草材料进行遗传变异和聚类分析的结果表明 :羊草种内有高频率的遗传变异发生 ,且与地理分布和生态环境密切相关 ;2 7份羊草不同基因型被划分为四大类群 ,不同类群相互间的遗传距离相对较大 ,在树状图中表现为较远的亲缘关系。对羊草种内遗传变异发生的原因和品种的形成进行了初步讨论。     

Use of activated carbon coated with bentonite for increasing the sensitivity of pcr detection of Escherichia coli O157:H7 in Canadian oyster (Crassostrea gigas) tissue

A novel method for directly increasing the recovery of Escherichia coli O157:H7 and efficiently eliminating PCR inhibitors in oyster tissue without preenrichment was developed with the use of activated carbon coated with bentonite. The recovery of E. coli O157:H7 was significantly affected by the amount of bentonite used to coat the activated charcoal and the pH value of sample preparations. When 4.2 g of activated carbon were coated with 0.4 g of bentonite and seeded oyster samples were adjusted to a pH of 5.0, a high recovery of E. coli O157:H7 (91.6+/-4.4%) was obtained. Activated carbon, coated with bentonite, allowed the PCR detection of 1.5 x 10(2) CFU/g of oyster tissue which was equivalent to 30 genomic targets per PCR reaction. Without the use of activated carbon coated with bentonite, the minimum level of detection was 1.5 x 10(5) CFU/g of oyster tissue, which is equivalent to 3.0 x 10(4) genomic targets per PCR reaction. Three commercial DNA purification systems were used for comparison. The limit of detection with the Wizard DNA Clean-Up System and the Chelex(R)100 Resin was 1.5 x 10(3) CFU/g of oyster tissue which was equivalent to 3.0 x 10(2) CFU/PCR reaction. The QIAamp DNA Mini Kit resulted in a detection limit of 5 x 10(2) CFU/g of oyster tissue which was equivalent to 5 x 10(2) genomic targets per PCR reaction. The use of activated carbon coated with bentonite is an inexpensive method for removal of PCR inhibitors from tissue samples prior to the release of DNA from target cells resulting in relatively low numbers of target cells detected without enrichment.     

利用RAPD分析披碱草属、鹅观草属和猬草属模式种的亲缘关系

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对小麦族披碱草属、鹅观草属和猬草属3个属的模式种进行了基因组DNA多态性分析。42个引物产物的290条谱带中,257条（88.62%)表现出多态性,说明披碱草属、鹅观草属和猬草属3个属的模式种间具有丰富的遗传多样性。利用290个RAPD标记,计算材料间Nei氏遗传相似性系和遗传距离,在NTSYS程序中利用UPGMA进行聚类。结果表明,Elymus sibiricus种不同居群间的遗传差异较小,遗传距离在0.097-0.180之间。E.sibiricus,Roegneria caucasica和Hystrix patula的种间遗传差异明显,遗传距离在0.458-0.605之间。H.patula与E.sibiricus的亲缘关系较近。R.caucasica与E.sibiricus的亲缘关系较远。     

Construction of Genetic Fingerprints of Aneurolepidium chinensis Using Microsatellite Sequences

The genetic fingerprints of Chinese wildrye ( Aneurolepidium chinensis (Trin.)Kitag) were constructed by Southern blot analysis of Ase Ⅰ-,Dra Ⅰ-,Eco RⅠ-,Hin dⅢ-,NcoⅠ-,MobⅠ-,RsaⅠ-,PstⅠ-, TaqⅠ- digested genomic DNA probed with synthesized oligonucleotide,（CT）8,（GCTA）4,（GGAT） 4 or（GACA） 4 .The difference between “Jisheng 4" and Chinese wildrye was shown by RFLP analysis of Dra Ⅰ-or Rsa Ⅰ- digested genomic DNAs probed with GCTA）4 .DNA fragments were obtained by PCR performed with genomic DNA of “Jisheng 4" as a template and（CT）8,（GCTA）4,（GGAT）4　or（GACA）4 as primer. Five size 2325,1455,876,774 and 299 bp fragments were amplified when (GGAT) 4 was used, indicating satisfied results were obtained.     

桃AFLP技术体系的优化及集群分离分析研究

在以桃为试材,优化AFLP技术体系及集群分离分析的研究中。研究得出：(1)高质量的基因组DNA、预扩增及选择性扩增模板的适宜浓度足影响分析结果的重要因素;(2)预扩增引物可选择E O／M O或E O／M 1组合。对扩增条带数的影响不显著;(3)选择性扩增引物组合E 2／M 3、E 3／M 3均适合桃基因组比较研究。但从揭示的多态性来说还是前者较高;(4)组建近等基因池的个体数将影响标记的筛选效率,试验叶中由6株个体组成的近等基因池较适宜多态性片段的筛选。     

BstNI同功酶限制—修饰系统基因的表达检测和定位分析

鉴定了Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１和ＪＭ１１０的部分遗传标记,作为受体菌分别用于ＢｓｔＮＩ同功酶限制－修饰系统中限制性内切酶（Ｒ）基因和甲基化酶（Ｍ）基因表达的检测。用外切酶Ⅲ单向删切含Ｒ－Ｍ基因的ＤＮＡ片段,获得２３个缺失突变亚克隆。通过检测各亚克隆表达的Ｒ酶和Ｍ酶活性,将Ｒ和Ｍ基因分别定位在距克隆位点ＰｓｔＩ和０．２→１．４ｋｂ和１．５→３．３ｋｂ范围内。分析表明：该系统属于Ⅱ类限制－修饰系统,两     

Plasmid, phage, and genomic DNA-mediated transfer and expression of prokaryotic and eukaryotic genes in cultured human cells

Transfection of mammalian cells with genomic DNA and cloned genes is now relatively routine. However, the vast majority of studies have used rodent cells as recipients. Here we describe efficient transfection of two human cell lines, the hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HPRT)-deficient HeLa line, D98/AH-2, and the adenine phosphoribosyltransferase (APRT)-deficient HT1080 line, HTD114. D98/AH-2 cells were transfected with the pSV2-gpt plasmid of Mulligan and Berg, which contains the E. coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (gpt) gene, and Gpt + transfectants were selected in HAT medium. HTD114 cells were transfected with (1) genomic hamster DNA, and ouabain resistant transfectants were selected in 5 X 10(-7)M ouabain; (2) with hamster and mouse genomic DNA, and Aprt + cells were selected in AAA medium; (3) with plasmids containing either the cloned hamster or mouse APRT genes, and Aprt + cells were selected; and (4) with phage particles containing a cloned mouse APRT gene, and Aprt + cells were selected. Transfection efficiencies ranged from 0.25 to 1.5 X 10(3) transfectants per microgram DNA, and in certain cases secondary transfections were done. Foreign DNA in recipients was detected by blot hybridization, and the expression of foreign genes was detected by cell growth in selective media and the expression of enzymes characteristic of the species of the donor DNA. The majority of transfectants showed stable expression of the transgenome.