小鼠大脑皮质星形胶质细胞原代培养与鉴定

为探讨简便、高效的大脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,本研究取新生24 h内的ICR小鼠大脑皮层,采用物理方法将其分成约1 mm^3,震荡过滤后进行培养。通过拍照的方式记录原代培养1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和原代培养14 d后再传代培养14 d(记为P2-14 d)细胞形态;通过实时定量PCR和Western blotting比较原代培养1周、2周、3周、4周、5周和原代培养2周后再传代培养2周(即P2-2)的星形胶质细胞内胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)基因和蛋白水平变化。选取GFAP、S100-β和谷氨酸转运蛋白(excitatory amino acid transporter 1,EAAT1)标记星形胶质细胞,微管相关蛋白(microtubuleassociated protein 2,MAP-2)、离子钙接头蛋白-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1)和髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)抗体分别标记神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。通过免疫荧光染色鉴定细胞种类及纯度。研究结果显示细胞生长良好,原代培养4周星形胶质细胞内GFAP比2周、3周、5周和传代培养2周的细胞更加稳定。经免疫荧光鉴定,星形胶质细胞纯度在95%以上。本实验采用相对较简单经济的方法培养出高纯度且生理状态相对较稳定的原代星形胶质细胞,该细胞模型不仅可以用于星形胶质细胞生理功能研究,还可以用于中枢神经系统相关疾病的体外研究。     

小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定

本研究通过体外分离培养及鉴定原代小鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons,CGNs),为神经科学研究提供原代神经元细胞模型。取生后第7天的ICR乳鼠小脑,在解剖体视镜下剥离脑膜及血管,经刀片切碎、0.25%胰酶消化、移液器吹打、70μm尼龙滤网制备单细胞悬液,差速贴壁后接种于新鲜配置的培养基。倒置相差显微镜观察不同时间CGNs的形态变化。采用神经元的标记蛋白微管相关蛋白-2(microtubule associated protein 2,MAP2),星形胶质细胞的标记蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),小胶质细胞的标记蛋白(type 3 complement receptor,CR3/CD11b)进行免疫荧光检测培养的原代CGNs纯度。原代培养CGNs接种20 min后即贴壁良好,培养24 h后细胞伸出突起,培养第7天神经元成熟,形成丰富的轴突,树突和胞间突触连接。经免疫荧光鉴定,CGNs纯度可达95%以上。成功体外分离培养出高纯度的原代CGNs,可应用于CGNs的体外研究。     

树鼩脑星形胶质细胞的体外培养及纯化

本文旨在建立低等灵长类动物树鼩(Tupaia belangeri)脑星形胶质细胞(astrocyte,AS)原代培养及纯化的技术,为利用新型实验动物树鼩进行研究工作而建立体外模型。将新生树鼩大脑皮质机械分离,置于4°C冰箱20min以损伤神经元,皮质组织块用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液,分次贴壁去除成纤维细胞,培养的混合细胞在每次换液时用0.005%胰蛋白酶轻柔漂洗去除神经元。细胞长满培养瓶底面积约70%时,用0.025%胰酶溶液静置消化,至肉眼可见一层白色薄膜从瓶底脱落时终止消化,此白色薄膜即为AS层。AS传至第三代时,用抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体进行免疫组织化学染色和免疫荧光染色鉴定。结果显示,本方法所得的树鼩脑AS的纯度可达98%以上。该结果提示,这种通过分次贴壁法结合差异消化的培养及纯化技术可获得高纯度的树鼩脑AS,为建立神经系统疾病新的体外细胞培养模型打下了基础。     

原代培养星形胶质细胞和小胶质细胞的特性与鉴定

本研究旨在明确原代培养的星形胶质细胞和小胶质细胞不同代次的生长特性,优化高效获取状态一致细胞的技术方法。将新生乳鼠的脑组织进行原代分离培养胶质细胞,通过细胞增殖检测试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）测定混合胶质细胞增殖曲线,使用流式细胞术检测两类细胞比例,并通过免疫荧光染色鉴定两类胶质细胞分型情况。生长曲线显示P0和P1代混合胶质细胞增殖活力最好;通过170 r/min机械振摇30 min可获得97.3%的高纯度小胶质细胞,该纯化方法得到的P0、P1、P2代离子钙接头蛋白-1（ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1）阳性小胶质细胞的形态及其M1、M2表型比例无代次差别;通过星形胶质细胞表面抗原-2（astrocyte cell surface antigen-2,ACSA-2）磁珠抗体分选的方法可获得纯度达到95.7%的星形胶质细胞,该纯化方法得到的P0、P1、P2代胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）阳性星形胶质细胞的形态及其A1、A2表型比例无代次差别。本研究详述了原代分离培养的小胶质细胞和星形胶质细胞的生长特点,证明了获取两类胶质细胞的最佳代次,优化了获取两类胶质细胞的技术方法,验证了连续培养两代不会影响其功能表型。本结果为研究神经系统炎症相关疾病的分子机制提供了技术支撑。     

X射线对体外培养星形胶质细胞增生活化和分泌的影响

目的观察X射线照射对培养星形胶质细胞(astrocyte,AS)增殖和分泌的影响。方法建立体外培养大鼠纯化的AS物理损伤模型(划痕损伤模型),分为对照组、划痕组和放疗组。利用免疫荧光观察胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxy uridine,BrdU)的表达,利用RT-PCR观察细胞因子IL-6和TNF-a的表达。结果划痕损伤刺激能使培养AS反应性增生活化。损伤后6h出现IL-6、TNF-a表达水平增高,24h后损伤周围BrdU阳性细胞率明显增加。通过X射线照射能抑制AS的BrdU表达,但并不能抑制损伤后IL-6和TNF-a的表达。结论X射线照射可以通过调控细胞周期,有效抑制损伤后AS的反应性增生,但不能对活化AS的IL-6和TNF-a的表达起到抑制作用。     

RCMV感染星形胶质细胞对神经干细胞分化的影响

探讨大鼠巨细胞病毒（rat cytomegalovirus,RCMV）感染大鼠星形胶质细胞后,对神经干细胞分化的影响。原代分离培养新生大鼠星形胶质细胞和胚胎海马神经干细胞,将星形胶质细胞感染RCMV后和神经干细胞在Transwell24孔共培养体系下进行共培养,同时设对照组;用免疫荧光染色等方法检测神经干细胞与感染RCMV的星形胶质细胞共培养后,其分化细胞中神经元微管相关蛋白（microtubule-associated protein 2,MAP2）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（glial fibril—lary acidic protein,GFAP）的表达。结果发现,感染RCMV的星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞分化减慢,分化成的神经元和星形胶质细胞比率低于对照组,提示星形胶质细胞感染RCMV后可抑制神经干细胞的分化,可能与RCMV影响星形胶质细胞合成和分泌各种营养因子,干扰了神经干细胞的分化进程有关。     

13-甲基十四烷酸对大鼠脑皮层星形胶质细胞氧反常的影响

目的研究13-甲基十四烷酸(13-methyltetradecanoic Acid,13-MTD)对大鼠脑皮质星形胶质细胞氧反常的保护作用。方法传代培养新生SD乳鼠大脑皮质星形胶质原代细胞,以氧糖剥夺/再复氧糖(OGD/R)方法复制氧反常模型,OGD 10 h/R 24 h,于再复氧糖即刻分别给予13-MTD 20,40,80μg/m L(M20,M40,M80)干预,倒置显微镜动态观察星形胶质细胞形态,细胞免疫化学鉴定角质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),MTT法检测线粒体活性,免疫组化法检测星形胶质细胞的水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)蛋白表达。结果OGD 10 h/R 24 h损伤后,体外培养的SD乳鼠脑皮质星形胶质细胞出现明显损伤,线粒体活性显著下降(P0.01),星形胶质细胞膜AQP4蛋白表达量明显增加(P0.01);与模型组比较,13-MTD 20,40,80μg/m L可减少损伤,使线粒体活性上升、AQP4蛋白表达减少,以80μg/m L效果最好(P0.01)。结论 13-MTD可通过降低AQP4的表达,提高线粒体活性,减轻细胞水肿,进而保护氧反常诱导的星形胶质细胞损伤。     

LPS诱导海马星形胶质细胞活化与活化的星形胶质细胞对海马神经元的影响

探讨脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对长时间存活大鼠海马内星形胶质细胞的反应以及对神经元的影响。方法:本实验用10只健康成年雄性SD大鼠,海马CA3区注射LPS 10μ1．7和14d后,尼氏染色观察神经元的变化,免疫组织化学染色结合图像分析方法观察海马CA3区注射部位胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)、的表达变化。结果:脂多糖可促进海马星形胶质细胞的活化,但并不能引起海马区神经元的损伤。结论:星形胶质细胞在脑损伤后的脑内炎症反应起了一定的作用,但并不能引起神经元的损伤。     

小鼠大脑皮质星形胶质细胞的原代培养及鉴定

为了体外分离培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞(astrocyte,AS)。取新生24 h内ICR乳鼠,超净台内断头取脑,体视显微镜下剥除脑膜、血管及海马,获得完整的大脑皮层组织,经手术刀切碎组织,旋涡震荡,过两次尼龙筛网以制备单细胞悬液,接种于35 mm塑料培养皿,倒置相差显微镜下观察细胞形态学状况,培养至3~4周,进行星形胶质细胞标记性蛋白胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光鉴定细胞纯度。本研究表明,倒置相差显微镜下观察细胞于接种后2~3 d大部分贴壁,生长至7 d左右即铺满皿底,3~4周细胞生长成熟,胞体较大,形状不规则,呈"铺路石"(cobblestone-like structure)状,免疫荧光鉴定可见GFAP阳性细胞占细胞总数比例达95%以上。通过以上方法可获得高纯度星形胶质细胞,为下一步实验提供大量生长状态良好的细胞。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的限制性细胞培养

介绍一种新的脑组织星形胶质细胞培养方法即限制性细胞培养（constraint cell culture）。常规分离纯化星形胶质细胞,将其低密度种植,维持在添中低量血清的化学成分限定的培养基中培养,并在长时期内不给予更换或补加培养液。利用波形蛋白(vimentin）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrary acidic protein）抗体的免疫荧光染色法鉴定观察不同培养时期的星形胶质细胞及其形态学变化。结果发现星形胶质细胞在最初的5天之内有一定程度的增殖,未出现过度增殖导致的细胞相互融合现象;接下来的3－5天内细胞形态明显分化,星形胶质细胞突起细长、胞体明显缩小、形态多样,最后细胞突起之间相互连接形成星形胶质细胞网络,并在相当长的时间内保持不变。实验结果显示在限制细胞种植密度和限制给予培养液的培养条件下星形质细胞的体外形态发育与在体的情形基本一致。提示该细胞培养方法可能有助于研究中枢神经系统中星形胶质细胞的生理功能。     

脱细胞神经移植物对骨髓间充质干细胞的诱导分化

目的探讨脱细胞神经移植物诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞的可行性。方法将分离纯化的SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增,行表型鉴定后,取第5代细胞,诱导组采用脱细胞神经移植物匀浆进行诱导,非诱导组加入等量无血清培养基,倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫细胞化学染色检测诱导后细胞S-100,神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的表达情况。结果BMSCs表型鉴定为CD44+、CD54+、CD34-,免疫细胞化学染色GFAP、S-100的阳性表达率分别为为(42±4)%和(64±5)%。结果 脱细胞神经移植物可诱导骨髓间充质干细胞分化为施旺细胞样细胞。     

光激活背侧海马星形胶质细胞Rac1抑制小鼠关联性记忆的形成

Rac1属于小G蛋白Rho GTPases家族的一员,通过调控细胞骨架及形态影响细胞迁移、轴突导向等生理过程,在脑内发挥重要作用。但Rac1的动态激活过程对脑内的生理学功能的影响尚不明确。近期报道可通过Rac1的光活化形式(photoactivatable Rac1,PA-Rac1)实现对Rac1活性的时空特异性操控。因此,我们构建并包装了由小鼠胶质原纤维酸性蛋白(mouse glial fibrillary acidic protein,m GFAP)启动子驱动的PA-Rac1及其光脱敏(light-insensitive)突变体PA-Rac1-C450A的腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV),拟通过光刺激实时操控星形胶质细胞内Rac1的活性。我们将AAV-PA-Rac1及AAV-PA-Rac1-C450A感染原代星形胶质细胞。荧光实时成像实验结果显示光刺激表达PA-Rac1的原代星形胶质细胞时,在光刺激点附近表现出细胞膜的突起,而光刺激表达PA-Rac1-C450A的原代星形胶质细胞时,其细胞膜形态无明显改变。为进一步探究Rac1激活对小鼠关联性学习的影响,我们在小鼠背侧海马脑区注射AAV-PA-Rac1及AAV-PA-Rac1-C450A,在条件恐惧性记忆的训练过程中光激活背侧海马的Rac1。结果显示,表达PA-Rac1的小鼠在训练过程中的学习曲线显著低于对照组,而表达其突变体PA-Rac1-C450A组小鼠学习曲线和对照组相比无显著差异,表明光激活海马星形胶质细胞Rac1抑制了小鼠条件性恐惧记忆的形成。以上结果提示,背侧海马星形胶质细胞Rac1的激活参与小鼠的场景关联性学习过程。     

成年转基因小鼠嗅鞘细胞的培养、纯化及生物学特性

已有多项研究表明,嗅鞘细胞具有修复中枢及外周神经损伤的潜能。我们选用了表达增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）的成年小鼠,分离其双侧嗅球嗅神经纤维层及嗅小球层细胞,体外原代培养并予以纯化。同时结合共聚焦、相差显微镜,细胞增殖分析及免疫组织化学鉴定等技术,对其生物学活性进行研究。结果表明：（1）原代培养转基因成年小鼠嗅球嗅鞘细胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）15d后,主要存在两种不同形态和免疫组织化学特征的细胞。一种是带有长突起的双极或多极OECs,表达P75^NTR（P75 low affinity neurotrophic receptor）、S100和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）。另一种则是对Thy 1．1抗体免疫反应阳性,呈扁平或内皮样形态的成纤维细胞。（2）根据不同类型细胞在未覆层的培养器皿上贴壁速度的差异,我们建立了一种简单易行、不需任何抗体或昂贵仪器的细胞纯化方法,获得了大量高纯度的OECs。（3）在连续纯化培养22d后,OECs仍能保持较高的增殖活性。本实验支持和丰富了OECs发育的相关理论,为进一步体内移植修复CNS损伤提供了理想的材料。     

大鼠皮质星形胶质细胞尼古丁型乙酰胆碱受体的表达

该文研究了尼古丁型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,n ACh Rs)不同亚单位在大鼠大脑星形胶质细胞的表达情况。分离新生大鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并纯化、传代鉴定后,运用RT-PCR方法、蛋白质印迹法检测正常大鼠大脑皮质星形胶质细胞n ACh Rs不同亚单位的表达情况。结果显示,α2、α3、α4、α7、β2等n ACh Rs亚单位在星形胶质细胞均有表达,而β3 n ACh Rs亚单位在星形胶质细胞没有表达,为深入研究星形胶质细胞的功能提供了可能。     

胶质原纤维酸性蛋白的研究进展

星形胶质细胞（astrocyte,AS)约占正常成人中枢神经系统（central nervous system,CNS)细胞总数的40％,其重要功能日益受到重视,AS可特异性表达胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP).GFAP是AS骨架蛋白特有的成分,可作为AS的特异性标记物,本文主要从分子生物学角度,就GFAP在复杂的细胞活动（如细胞骨架重建,髓鞘维持,细胞粘附和信号转导途径等）中的广泛作用,及GFAP转基因动物研究等做一综述。     

活化星形胶质细胞NGF、IL-6表达的时间特性

目的:研究星形胶质细胞活化后神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达的时间规律性,探讨星形胶质细胞活化后启动保护性机制与损伤性机制的时间特性.方法:体外分离培养星形胶质细胞,分为对照组、活化组、抑制组.通过光学显微镜及免疫荧光化学观察各组细胞的形态变化;应用半定量RT-PCR方法分析各组细胞间胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mRNA及NGF mRNA、IL-6 mRNA表达变化;用ELISA法检测各组细胞上清液中不同时间点(6h,24h,48h,72h)NGF、IL-6的含量.结果:活化组与对照组比较,细胞胞体变大,GFAP荧光增强;RT-PCR示GFAP mRNA、NGF mRNA、IL-6 mRNA表达均明显增高,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01);ELISA法检测示星形胶质细胞活化后NGF分泌量在活化后24小时达到高峰,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01);活化后48小时IL-6的含量达到高峰,与对照组比较差异有显著性(P＜0.01);应用抑制剂Genistein干预后,与活化组相比,抑制组细胞胞体变小,星形胶质细胞活化被抑制,GFAP mRNA表达下降,NGF mRNA、IL-6 mMRA表达亦下降,与活化组比较差异有显著性(P＜0.01).结论:星形胶质细胞活化后NGF、IL-6表达均上调,但NGF表达时间早于IL-6表达时间,表明在星形胶质细胞活化的早期,可能其神经保护作用占主导,而后期其神经毒性作用逐渐明显;Genistein能抑制星形胶质细胞活化,使NGF、IL-6表达下调.     

成年大鼠吻侧迁移流的神经发生

目的探讨成年SD大鼠吻侧迁移流(rostral migratory stream,RMS)的神经发生。方法成年6周龄SD大鼠被处死。矢状位切片,免疫组织化学染色观察RMS区微管相关蛋白双皮质素(doublecortin,DCX)及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达及DCX/GFAP、DCX/p-CREB的共表达情况。结果在RMS区的垂直臂、肘部、水平臂均有DCX阳性细胞和GFAP阳性细胞,RMS区有GFAP/DCX和p-CREB/DCX共表达细胞。结论吻侧迁移流有广泛的神经元前体细胞及星形胶质细胞标记物表达;迁移神经元标记物可表达于星形胶质细胞,且神经元的迁移受到CREB信号通路的调控。     

胰蛋白酶消化强度优化获得高纯度体外培养的星形胶质细胞

本文旨在观察胰蛋白酶消化对体外培养的星形胶质细胞纯度的影响,优化星形胶质细胞培养方法。常规分离新生Sprague Dawley(SD)大鼠大脑皮质,分别用0.25%胰蛋白酶消化20、30和40 min制备单细胞悬液并接种细胞。细胞长满瓶底时进行恒温摇床振荡,前两个不同消化时间组再分为常规消化的对照组和二次胰蛋白酶消化组进行传代纯化。倒置相差显微镜观察细胞生长情况,MTT法检测细胞增殖,GFAP免疫荧光分析星形胶质细胞纯度并观察其形态,流式细胞术分析细胞凋亡。结果显示,胰蛋白酶消化20 min的细胞在原代培养9 d长满瓶底。而延长胰蛋白酶消化时间至30 min,细胞增殖更快,培养7 d即可铺满瓶底,且星形胶质细胞形态正常,纯度达(70.2±4.0)%,较20 min组有显著性提高(P0.05)。40 min组虽然星形胶质细胞纯度也较20 min组有所提高,但细胞增殖缓慢且损伤明显。在恒温摇床振荡结束后,进行二次胰蛋白酶消化可减少传代后杂细胞数量。二次胰蛋白酶消化组第一代(P1)的GFAP阳性率普遍高于各自对照组,其中30 min+二次胰蛋白酶消化组GFAP阳性率为(98.1±1.7)%,相当于20 min+对照组P3水平,且二者的凋亡率无显著性差异。以上结果表明,胰蛋白酶消化30 min+二次消化能有效提高星形胶质细胞纯度,缩短原代培养及纯化时间,是体外快速获得高纯度星形胶质细胞的有效方法。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞条件培养液促进小脑皮质神经元的生长

本研究从大鼠大脑皮质分离、纯化星形胶质细胞,再经培养后收集星形胶质细胞的无血清条件培养液。用盖玻片培养法与快速自动比色微量分析法研究了星形胶质细胞条件培养液对小脑皮质神经元生存以及神经元活力的影响。发现星形胶质细胞条件培养液能够明显提高小脑皮质神经元的体外存活率,增强神经元的活力。表明星形胶质细胞具有神经营养性作用。     

大鼠局灶性脑缺血后星形胶质细胞过度增殖对局部微循环的影响

目的 观察局灶性脑缺血后海马和缺血边缘区星形胶质细胞过度增殖对微循环的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、缺血组和干预组,缺血组和干预组采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型,缺血组侧脑室采用ALZET微渗透泵给予0．2％DMSO,干预组给予细胞周期抑制剂roscovitine,假手术组不插入线栓,不给与任何药物干预。缺血7d后于股静脉注入FITC标记的葡聚糖标记血管,小鼠抗大鼠单克隆抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗体标记星形胶质细胞;激光共聚焦三维成像显示胶质细胞于微循环之间的关系。结果缺血同侧海马和缺血边缘区在GFAP阳性细胞增多的同时,局部微血管血流灌注明显减少,应用细胞周期抑制剂roscovitine抑制星形胶质细胞增生可以明显增加局部微血管的血流灌注。结论脑缺血后缺血边缘区和海马的反应性星形胶质细胞增生与微循环灌注减少密切相关。