p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏病理学研究

目的观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏病理学改变.方法分别选取2、6、12、18、24月龄的SPF级p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠和p21+/+野生型小鼠,剖检进行大体观察,取肝脏及肝脏肿瘤组织,进行组织学HE染色及电镜超微结构观察.结果 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏大体、光镜和电镜下均有明显病理改变.随着月龄的增加,肝脏色暗质硬,表面有结节和肿瘤形成;光镜下,肝细胞浊肿,炎症细胞浸润,脂肪变性,点状、灶状和碎屑状坏死,非典型增生,肝细胞癌.癌细胞分化良好,类似肝细胞,形成索状和腺泡状结构.癌细胞核深染,具核分裂像.电镜下,癌细胞核变形,核膜曲折凹陷,线粒体肿胀,数目增多,嵴减少.4例18月龄转基因小鼠发生肝细胞癌(4/10),6例24月龄的转基因小鼠发生肝细胞癌(6/10),其中2例发现远处转移.结论 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝脏出现明显病理损害,18月龄小鼠开始发展成高分化的肝细胞癌,高龄小鼠形成的肝细胞癌能够转移.     

p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌发生过程中PCNA的表达及意义

[目的]探讨乙型肝炎病毒表面抗原定位整合(p21HBsAg/HbsAg)转基因小鼠肝癌发生过程中PCNA的表达及意义。[方法]分别选取2,6,12,18,24月龄的SPF级转基因小鼠,取肝脏及肝脏肿瘤组织,进行免疫组织化学S-P法染色。[结果]①阳性肝细胞核内可见棕黄色反应颗粒;②2,6月龄转基因小鼠肝脏有少量散在分布的肝细胞呈PCNA阳性表达,阳性率分别为2.5%,3%;12月龄转基因小鼠肝脏PCNA阳性表达主要出现在非典型增生的肝细胞,阳性率23.65%;18月龄转基因小鼠发生的肝细胞癌PCNA阳性率61.68%;24月龄的转基因小鼠发生的肝细胞癌PCNA阳性率63.56%。12月龄转基因小鼠PCNA阳性率高于2,6月龄转基因小鼠(p<0.01),18月龄和24月龄的转基因小鼠PCNA阳性率高于12月龄转基因小鼠(p<0.05)。[结论]①PCNA能准确反映乙型肝炎病毒表面抗原定位整合转基因小鼠肝细胞的增殖能力,PCNA与肝细胞癌的发生、发展密切相关;②非典型增生的肝细胞有较高的PCNA阳性表达,是一群具有肿瘤增殖潜能的癌前细胞群。     

透射电镜观察p21-（HBsAg/HBsAg）转基因小鼠肝癌细胞凋亡

目的观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡。方法用透射电镜观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡的形态学改变。结果细胞凋亡早期,细胞核染色体发生边集,核形不规整,核膜表面凹凸;凋亡中期,核内染色质凝聚,趋边呈月牙状,核膜孔消失,核膜呈波纹状皱缩;凋亡晚期,核固缩,细胞膜出芽形成小泡,可见凋亡小体。结论p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡具有典型性病变特征,是研究HBV感染诱发肝癌发病机理的合适动物模型。     

透射电镜观察p21HBHBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡

目的 观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡.方法 用透射电镜观察p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡的形态学改变.结果 细胞凋亡早期,细胞核染色体发生边集,核形不规整,核膜表面凹凸;凋亡中期,核内染色质凝聚,趋边呈月牙状,核膜孔消失,核膜呈波纹状皱缩;凋亡晚期,核固缩,细胞膜出芽形成小泡,可见凋亡小体.结论 p21HBsAg/HBsAg转基因小鼠肝癌细胞凋亡具有典型性病变特征,是研究HBV感染诱发肝癌发病机理的合适动物模型.     

p16在HBsAg和HBx转基因小鼠肝脏肿瘤中的表达

目的:探讨p16基因在由乙型肝炎病毒基因整合引起的小鼠肝细胞癌发生发展中的表达变化规律。方法:以乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)及X基因(HBx)定位整合转基因小鼠及对照小鼠的肝脏组织为标本,利用North-ern印迹、Western印迹及免疫组织化学检测p16在乙肝病毒基因定位整合转基因小鼠肝脏正常组织与肿瘤组织中的差异表达。结果:p16主要在小鼠胚胎期的肝脏中表达,在新生小鼠和成年小鼠的肝脏组织中几乎检测不到其表达;在HBsAg转基因小鼠和HBx转基因小鼠的肝脏肿瘤中,p16的表达明显升高。结论:p16基因在HBsAg或HBx诱导的肝细胞癌发生过程中被重新激活,也许发挥重要的作用。     

不同月龄p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBX/HBX转基因小鼠血清酶含量的测定

目的测定p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBX/HBX转基因小鼠纯合型及野生型小鼠的血清酶,探讨各种血清酶在两种纯合型小鼠及野生型小鼠的变化规律。方法采用荷兰半自动生化分析仪Ⅱ对于肝功能相关的7种血清酶进行测定,应用SSPS10统计学软件进行T检验及方差分析比较。结果p2^1HBsAg/HBsAg和p21^HBX/HBX转基因小鼠不同年龄、不同的指标雌雄之间差异显著,并且随着年龄的变化,雌雄之间的变化规律不同。结论p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBX/HBX转基因小鼠的血清酶在不同的年龄具有一定的变化规律,说明p21^HBsAg/HBsAg和p21^HBX/HBX转基因小鼠的血清酶具有一定的特征,为其功能性研究及临床检验具有重要参考价值。     

氯化镨在小鼠肝脏细胞中形成含镨致密体

本实验给小鼠4次注射氯化镨(总剂量为200mg/kg)后,光镜发现肝细胞呈嗜酸变性或空泡变性,肝细胞与枯否细胞中酸性磷性酶阳性的溶酶体增多。电镜观察到肝细胞出现程度不同的核变形、内质网扩张、糖原缺乏、溶酶体含较多高电子密度微粒。肝细胞与枯否细胞中均出现由高电子密度微粒聚集形成的致密体,应用X射线微区分析术可测到镨特征性能谱峰。     

大剂量HBsAg对HBV转基因小鼠T细胞免疫调节的研究

目的：研究大剂量HBsAg对HBV转基因小鼠其T细胞免疫效果的影响。方法：用大剂量血源性HBsAg免疫HBV转基因小鼠,采用ELISA方法观察转基因小鼠所诱生的HBsAg特异性Th1类细胞因子的水平,ELISPOT方法检测不同免疫方案对小鼠HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量的影响,同时检测对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果：HBsAg组免疫后脾细胞产生的Th1类细胞因子（IFN-γ、IL-2）、HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞及T细胞增殖水平较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：大剂量的HBs-Ag可以诱导乙肝转基因小鼠产生高水平Th1类细胞因子并打破免疫耐受。     

C-myc、p53基因和AFP在家兔诱发性肝癌及癌旁组织中的表达

目的获得家兔二乙基亚硝胺诱发肝脏肿瘤的形态学资料,探讨Cmyc、p53基因和甲胎蛋白的表达情况。方法取5例家兔多结节肝癌的肿瘤性结节25个,瘤旁肝组织每例1块,进行一般病理组织学和超微结构观察。同时,以免疫组化方法检查Cmyc、p53基因和AFP的表达情况。结果和结论25个结节中,良性增生10个,高分化肝细胞癌11个,中分化肝细胞癌4个。家兔肝细胞癌的发生与Cmyc基因、AFP的过表达和p53基因的突变有关。参照肿瘤诱发过程中,增生性肝硬化、腺瘤样增生、高分化癌、中分化癌的变化顺序,在所检测的三种标志物中,Cmyc蛋白为最早出现的肿瘤标志物,p53基因突变相对较晚出现,AFP在恶性肿瘤结节中的表达率最高(933%)。     

佐剂CpG-ODN与重组HBsAg疫苗联合免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫应答研究

目的 以CpG-ODN为佐剂与重组HBsAg(rHBsAg)疫苗合用,研究其对乙型肝炎病毒转基因(HBV Tg)小鼠模型的免疫应答效果.方法 40只HBV Tg小鼠随机分为4组,每组小鼠分别注射rHBsAg疫苗(单用rHBsAg组)、rHBsAg疫苗+CpG-ODN(试验组)、rIFNα-2b(IFN组)、生理盐水(对照组).经多次免疫HBV转基因小鼠,于免疫前、后不同时间采血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、抗-HBs阳性率和HBV DNA的变化,检测肝组织中HBsAg的表达.检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群和白细胞介素2(IL-2)、IL-12(p70)以及γ干扰素(IFN-γ)的含量,分别检测免疫小鼠的脾细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤功能并计算各组小鼠肝组织活性指数(HAI).结果 rHBsAg组和rHBsAg+CpG组在免疫小鼠后2周100%诱导抗-HBs;rHBsAg+CpG组能显著降低血清中的HBsAg量或使HBsAg转阴,rHBsAg+CpG组肝组织中HBsAg的表达量与血清中一样降低,并降低血清中HBV DNA的拷贝数.rHBsAg组的CD3+、CD4+、CD8+细胞在T细胞中所占百分比,IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量以及淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应均明显高于对照组(P＜0.05).rHBsAg+CpG组与rHBsAg组比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答(P＜0.05),且以Th1型细胞免疫应答为主.在rHBsAg+CpG组肝组织中出现大量淋巴细胞,肝脏的HAI在4个组中最高.结论 CpG-ODN作为佐剂可以增强重组HBsAg疫苗诱导HBV转基因小鼠产生抗病毒免疫应答,重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

The up-regulation of proteasome subunits and lysosomal proteases in hepatocellular carcinomas of the HBx gene knockin transgenic mice

Chronic infection of hepatitis virus B (HBV) has been proven to be one of the most important risk factors of hepatocellular carcinoma (HCC). HBx has been shown to function in the viral life cycle and the development of HCC. Recently, we have reported that HBx transgenic mice (p21-HBx), generated by gene knockin, develop HCC at the age of 18 months. To further study the function of HBx during the development of HCC in vivo, we performed proteomic analysis of the transgenic and wild-type control mice. The combination of 2-DE and MALDI-TOF MS revealed that proteasome subunits (PSMA6, PSMB4, PSMC2 and PSMD12) were up-regulated in tumor tissues of the p21-HBx transgenic mice. Cathepsin B, ubiquinol-cytochrome C reductase core protein 1 and an ATP-dependent caseinolytic protease, which were involved in the cellular proteolytic process, were also found increased in tumors. The results were confirmed in tumors of transgenic mice and HCCs of human using RT-PCR. All these results suggested that the strengthened ubiquitin-proteasome and lysosomal pathway might contribute to the development of HBx-related HCC.     

CpG Oligodeoxynucleotides with Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) for Vaccination in HBsAg-Transgenic Mice

DNA motifs containing unmethylated CpG dinucleotides within the context of certain flanking sequences enhance both innate and antigen-specific immune responses, due in part to the enhanced production of Th1-type cytokines. Here we explored the ability of CpG-containing oligodeoxynucleotides combined with recombinant hepatitis B surface antigen (HBsAg) to induce Th1 responses in mice that are transgenic for this antigen and that represent a model for asymptomatic hepatitis B virus chronic carriers. This was compared to hepatitis B virus-specific DNA-mediated immunization, which we have previously shown to induce the clearance of the transgene expression product and the down-regulation of hepatitis B virus mRNA in this transgenic mouse lineage. In control nontransgenic C57BL/6 mice, three immunizations with HBsAg and CpG triggered the production of anti-HBs antibodies and of HBs-specific T cells that secrete gamma interferon but do not display any HBsAg-specific cytotoxic activity. In the HBsAg-transgenic mice, immunization with HBsAg and CpG oligodeoxynucleotides, but not with CpG alone, induced the clearance of HBsAg circulating in the sera, with a concomitant appearance of specific antibodies, and was able to regulate the hepatitis B virus mRNA constitutively expressed in the liver. Finally, adoptive transfer experiments with CD8(+) T cells primed in C57BL/6 mice with HBsAg and CpG oligodeoxynucleotide-based immunization show that these cells were able to partially control transgene expression in the liver and to clear the HBsAg from the sera of recipient transgenic mice without an antibody requirement. CpG oligodeoxynucleotides motifs combined with HBsAg could therefore represent a potential therapeutic approach with which to treat chronically infected patients.     

应用酶联免疫吸附试验检测不同类型乙型肝炎中激活补体类HBsAg循环免疫复合物

本文以抗人C_(?)的羊IgG为包被抗体,以HRP-HBs抗体为指示抗体,建立了可检测激活补体类HBsAg循环免疫复合物(HBsAg/C3-CIC)的C_3捕捉法酶联免疫吸附试验。检测了236例六种类型临床诊断为乙型肝炎的病人血清标本,其阳性率分别为:无症状携带者(ASC)12.9％(4/31),急性肝炎(AH)36.7％(22/60),慢性迁延性肝炎(CPH)33.3％(7/21),慢性活动性肝炎(CAH)59.6％(34/57),重型肝炎(SH)77.8％(14/18),肝炎后肝硬化(PLC)67.3％(33/49),阳性率与肝损严重程度明显相关(P<0.01)。认为HBs-Ag/C3-CIC可能在乙型肝炎病毒引起的慢性活动性肝炎、重型肝炎和肝炎后肝硬化的发病过程中起重要作用,并可作为乙型肝炎的诊断、临床分型和预后判断的指标之一。