人乳头瘤病毒l6型E6-E7融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建人乳头瘤病毒l6型(HPV16)E6-E7融合蛋白真核表达载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E6-E7基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,双酶切及测序鉴定。将质粒转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E6-E7基因在HeLa细胞中的表达。提取质粒免疫小鼠,利用免疫组化方法检测在其肌肉组织中的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7;在转染pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7的细胞中检测到HPV16 E6-E7基因。在免疫该质粒的小鼠肌肉组织中可以检测到该质粒的蛋白表达。结论成功的构建的了真核表达载体pcDNA3.1(+)/HPV16 E6-E7,该载体能在HeLa细胞内以及小鼠骨骼肌细胞内有效表达。     

乙肝病毒X蛋白通过β-catenin通路调控肝癌细胞增殖、细胞周期的研究

乙肝病毒X蛋白(HBx)是由乙型肝炎病毒(HBV)DNAX基因编码的蛋白,具有促癌作用且与乙肝相关肝癌的发生有关,但其发挥促癌作用的机制尚不清楚.在乙肝相关肝癌中,β-连环蛋白(β-catenin)通路过度激活并介导了促进细胞增殖、加速细胞周期的效应.为了观察HBx是否通过β-catenin通路调控肝癌细胞增殖、细胞周期,本实验培养肝癌Huh7细胞株并分为对照组、转染HBx质粒的HBx组、转染HBx并用β-catenin抑制剂ICG-001处理的HBx+ICG-001组、转染HBx并用β-catenin抑制剂XAV939处理的HBx+XAV939组,检测细胞增殖活力OD490nm、细胞周期及生存素(survivin)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、c-myc、β-catenin、磷酸型GSK-3β(p-GSK-3β)的表达量.结果显示,HBx组的OD490nm水平、细胞周期S期、G2/M期的比例、survivin、bcl-2、cyclinD1、c-myc、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均高于对照组,细胞周期G0/G1期的比例低于对照组(P＜0.05);HBx+ICG-001 组、HBx+XAV939组的OD490nm水平、细胞周期S期、G2/M期的比例、survivin、bcl-2、cyclinD1、c-myc、β-catenin、p-GSK-3β的表达量均低于HBx组,细胞周期G0/G1期的比例高于HBx组(P＜0.05).结果表明,HBx促进肝癌细胞增殖、加速细胞周期的作用与激活β-catenin通路有关.本研究的创新之处在于阐明HBx促进肝癌细胞增殖、加速细胞周期的分子机制,激活β-catenin通路是介导HBx上述作用的分子机制之一,这也为今后乙肝相关肝癌的防治提供了新思路、新靶点.     

人乳头瘤病毒16型E7过表达细胞的鉴定及其迁移效应的影响

鉴定人乳头瘤病毒16型早期蛋白7(HPV16E7)过表达细胞及其迁移效应的影响,为后续基于HPV16E7靶向分子作用机制的研究奠定工作基础.脂质体转染法将本室保存的pcDNA3.1-HPV16E7重组真核表达质粒分别转染人胚肾293T细胞(HPV16型DNA阴性)、宫颈癌SiHa细胞株(HPV16 DNA阳性),转染48 h后收集细胞,提取RNA,RT-PCR扩增相应的目的基因,Western Blotting和间接免疫荧光实验检测HPV16E7目的蛋白在细胞中的表达.转染24h的细胞进行细胞划痕和Transwell实验,检测过表达细胞迁移行为的变化.RT-PCR结果显示:分别从E7质粒转染的293T、SiHa细胞的cDNA中,均可扩增到250 bp的目的条带;Western Blotting分析结果显示:以HPV16E7单克隆抗体为检测抗体,转染细胞的裂解液中均能在相对分子质量(Mr)约为15 000处出现特异性目的条带;间接免疫荧光结果显示:转染细胞中均能检测到目的绿色荧光,且分布于胞浆及细胞核周围;细胞划痕和Transwell实验结果显示:转染E7细胞的迁移效应显著提高.本研究证实了 HPV16E7转染细胞后可成功表达,且过表达细胞明显促进了细胞迁移行为,为后续基于HPV16E7迁移相关分子机制及靶向干预等研究奠定了前期工作基础.     

LncRNA ZNF667-AS1靶向 miR-31-5p对食管癌细胞增殖、迁移和凋亡的机制研究

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)ZNF667-AS1通过靶向miR-31-5p对食管癌细胞增殖和迁移的影响及潜在的机制。方法采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测ZNF667-AS1在食管癌细胞Eca109、EC1、TE1和正常食管上皮细胞Het-1A的表达水平,并选择表达差异最大的细胞株进行后续实验。采用脂质体转染技术将pcDNA3.1-ZNF667-AS1过表达重组载体质粒转染至人食管癌Eca109细胞,实验分为对照组(未行转染的Eca109细胞)、pcDNA3.1组(转染空载体质粒的Eca109细胞)和ZNF667-AS1组(转染pcDNA3.1-ZNF667-AS1质粒的Eca109细胞),qPCR技术检测pcDNA3.1-ZNF667-AS1的转染效果,噻唑蓝比色法(MTT)和平板克隆实验检测过表达ZNF667-AS1对Eca109细胞增殖能力的影响,Transwell实验检测Eca109细胞迁移能力,流式细胞术检测Eca109细胞凋亡率,Western blot检测Eca109细胞中G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、细胞周期依赖性激酶抑制因子(p21)、上皮标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、间充质标志物神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白X(Bax)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达水平,生物信息学预测ZNF667-AS1与miR-31-5p的互补配对关系,荧光素酶报告实验和qPCR技术验证ZNF667-AS1和miR-31-5p的靶向调控关系。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果与Het-1A细胞相比,食管癌Eca109、EC1和TE1细胞中ZNF667-AS1的表达水平均降低(1.00±0.08比0.29±0.04,0.36±0.05,0.33±0.06),差异有统计学意义(P<0.001)。与ZNF667-AS1组相比,对照组及pcDNA3.1组中ZNF667-AS1的表达水平(3.14±0.32比1.00±0.10,0.94±0.09),细胞活力[(63.42±3.75)%比100.00±4.85、(97.69±4.57)%],细胞克隆形成数[(34.26±3.52)个比(95.64±10.22)个、(92.80±10.04、个],Cyclin D1表达水平(0.26±0.05比0.75±0.08、0.71±0.07),迁移细胞数[(20.24±2.35)个比(63.55±6.04)个、(60.02±6.12)个],细胞中E-cadherin表达水平(0.19±0.02比0.48±0.05,0.49±0.05)和miR-31-5p的表达水平(0.30±0.03比1.00±0.10,0.95±0.09)均升高,p21表达水平(0.79±0.09比0.24±0.05,0.26±0.06),细胞凋亡率[(29.17±1.26)%比(3.41±0.73)%,(3.72±0.78)%],细胞中N-cadherin(0.87±0.09比0.42±0.04,0.40±0.04)、Vimentin表达水平(0.82±0.08比0.44±0.04,0.44±0.04)均降低,差异有统计学意义(P均<0.001),与对照组比较,pcDNA3.1组ZNF667-AS1的表达水平,细胞活力,细胞克隆形成数,Cyclin D1和p21表达水平,迁移细胞数,细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和miR-31-5p表达水平,细胞凋亡率差异无统计学意义(P均>0.05)。生物信息学预测发现ZNF667-AS1和miR-31-5p存在靶向结合位点;荧光素酶报告实验结果显示,与空载转染组比较,miR-31-5p组ZNF667-AS1-Wt相对荧光素酶活性(1.00±0.10比0.19±0.02)降低(P<0.05),ZNF667-AS1-Mut相对荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达ZNF667-AS1能抑制食管癌Eca109细胞的增殖、迁移并诱导其凋亡,其机制可能与ZNF667-AS1靶向调控miR-31-5p有关。     

OPN对卵巢癌Hey细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)对卵巢癌Hey细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其可能涉及的分子机制。方法:选择卵巢癌细胞株Hey、HO8910、A2780和正常卵巢上皮细胞IOSE80,采用Western blot检测OPN蛋白的表达情况。对OPN表达量相对较高的Hey细胞株的OPN基因敲减或过表达,运用CCK-8、平板克隆实验、细胞划痕、Transwell侵袭实验等方法研究OPN对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,采用Western blot检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc的表达情况。结果:OPN在卵巢癌细胞株Hey、HO8910、A2780内均有表达,且表达量均高于正常卵巢上皮细胞IOSE80。si RNA-OPN转染卵巢癌Hey细胞沉默OPN表达,CCK-8和平板克隆实验显示沉默OPN能够降低Hey细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell侵袭实验显示下调OPN可降低Hey细胞的迁移和侵袭能力,Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc表达下降。ex-OPN转染Hey细胞使OPN表达升高,与对照组相比,OPN过表达能够增强Hey细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、CyclinD1、c-myc表达升高。结论:OPN能够促进卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,该作用可能通过促进Wnt/β-catenin信号通路实现。     

长链非编码RNA LINC00885在人食管癌细胞中的作用研究

探讨长链非编码RNA LINC00885对人食管癌细胞EC109增殖、迁移与侵袭的影响。构建LINC00885基因过表达质粒（pcDNA3.1-LINC00885）和shRNA敲低质粒（pLKO.1-LINC00885）。分别采用集落形成实验检测EC109细胞增殖能力;划痕实验检测EC109细胞横向迁移能力;Transwell实验检测EC109细胞纵向迁移能力及侵袭能力;流式实验检测LINC00885对于细胞周期的调控;实时定量PCR方法检测LINC00885 mRNA转录水平;Western blot检测BMP7及上皮间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）通路相关蛋白（VIMENTIN、β-catenim和ZO-1）表达水平。在过表达LINC00885的EC109细胞中,细胞的增殖能力、迁移能力及侵袭能力均显著增强,BMP7蛋白表达升高;而在敲低表达LINC00885的EC109细胞中,细胞的增殖能力、迁移能力与侵袭能力均显著降低,BMP7蛋白表达也随之降低。另外,在过表达LINC00885的EC109细胞中,EMT通路蛋白VIMENTIN、β-catenim表达水平显著升高,而ZO-1表达水平显著降低。通过探究LINC00885对食管癌细胞增殖、迁移能力的影响,旨在验证LINC00885在食管癌中的功能,以期为临床治疗食管癌奠定理论基础。     

过表达Beclin 1对食管癌Eca109细胞株裸鼠成瘤的影响

自噬是一个进化上保守的溶酶体降解途径,激活自噬可以降解有缺陷的细胞器而发挥抑制肿瘤的作用,Beclin 1是关键的自噬和肿瘤抑制基因。该研究检测了Beclin 1蛋白在食管癌组织中的表达情况,构建Beclin 1的重组质粒并转染人食管癌Eca109细胞株。分别以电子显微镜观察自噬体的形成和Eca109细胞的自噬性死亡情况,RT-PCR检测Beclin 1基因的mRNA表达,Westernblot法检测Beclin 1及Bcl-2、P53的表达水平,裸鼠成瘤实验检测Beclin 1基因对Eca109细胞体内增殖的影响。结果显示,Beclin 1蛋白在食管癌组织中相对于癌旁正常食管组织低表达(P<0.05);成功构建了Beclin 1重组质粒并将其转染到Eca109细胞中,电子显微镜观察到自噬体形成,RT-PCR和Western blot显示Beclin 1基因过表达。升高Beclin 1蛋白的表达水平能降低Bcl-2表达和上调P53蛋白,使Eca109细胞的体内致瘤性减弱。过表达Beclin 1基因对食管癌有很好的抑制作用,这将为食管癌的靶向治疗奠定基础。     

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨miR-613对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移与侵袭的影响

摘要 目的：研究基于Wnt/β-catenin信号通路探讨微小RNA（miR）-613对宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移与侵袭的影响。方法：体外培养宫颈癌SiHa细胞和正常宫颈上皮细胞H8,检测细胞中miR-613表达。根据转染miR-613 mimic浓度不同,将SiHa细胞分为0 μmol/L组,100 μmol/L和200 μmol/L组。MTT法检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。蛋白免疫印迹法检测miR-613表达对Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Vimentin、E-cadherin和MMP9表达的影响。结果：宫颈癌SiHa细胞中miR-613表达水平均显著低于正常宫颈上皮细胞H8,差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-613 mimic后,100 μmol/L、200 μmol/L 组SiHa细胞中miR-613表达水平显著上调,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。与0 μmol/L组相比,100 μmol/L、200 μmol/L组的SiHa细胞增殖,迁移,侵袭能力均明显下降,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。免疫印迹结果,与0 μmol/L组相比,100 μmol/L、200 μmol/L各浓度组的SiHa细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin、Vimentin和MMP9表达显著下调,E-cadherin表达显著上调,并且具有浓度依赖性(P<0.05)。结论：miR-613能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制人宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖,迁移和侵袭。     

人巨细胞病毒US28基因通过HIF-1α途径促进结肠癌细胞的迁移、侵袭

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)的US28基因在结肠癌内呈高表达趋势且与淋巴结转移、Dukes分期进展密切相关,癌细胞过度的迁移和侵袭是造成淋巴结转移、Dukes分期进展的重要物学环节,US28基因表达的变化提示US28可能参与了结肠癌细胞迁移、侵袭的调控,但具体的作用及机制均未阐明。为研究HCMV US28基因促进结肠癌细胞迁移、侵袭的作用及机制,本研究培养结肠癌COLO205细胞株并分组,阴性对照组(NC组)用不含药物和质粒的DMEM处理,空白对照质粒组(NC质粒组)转染空白的pcDNA3.1质粒,US28质粒组转染过表达US28基因的pcDNA3.1质粒,US28质粒+YC-1组转染过表达US28基因的pcDNA3.1质粒、同时加入缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的抑制剂YC-1。检测细胞的迁移活力、侵袭活力、细胞中HIF-1α及下游迁移基因(HIF-1α、Snail)、侵袭基因(MMP1、MMP9)的表达量。结果显示,与NC组、NC质粒组比较,US28质粒组的迁移细胞数目、侵袭细胞数目及细胞中HIF-1α、Snail、MMP1、MMP9的蛋白表达水平均明显增多(P0.05),细胞中E-cadherin、TIMP2的蛋白表达水平均明显减少(P0.05);与US28质粒组比较,US28质粒+YC-1组的迁移细胞数目、侵袭细胞数目及细胞中HIF-1α、Snail、MMP1、MMP9的蛋白表达水平明显减少(P0.05),细胞中E-cadherin、TIMP2的蛋白表达水平均明显增多(P0.05)。综上,HCMV US28基因能够促进结肠癌细胞的迁移、侵袭且该作用与激活HIF-1α途径、调节下游迁移及侵袭基因表达有关。     

EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移

EBP50通过抑制LIMK/cofilin信号通路和PI3K/Akt/m TOR/MMP信号通路抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。然而,EBP50是否可以通过其他机制抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移尚未可知。本研究发现,EBP50能通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响乳腺癌细胞的侵袭和转移。Western印迹结果显示,EBP50在低转移细胞株MCF-7和正常乳腺细胞株MCF-10A中高表达,而在高转移细胞株MDA-MB-231低表达。采用RNAi技术将小RNA质粒瞬时转染乳腺癌细胞株MCF-7,同时将质粒pc DNA3.1-EBP50转入乳腺癌细胞株MDA-MB-231。Western印迹结果显示,Si EBP50/MCF-7细胞组的EBP50表达水平明显下调,MDA231/EBP50细胞组的EBP50表达水平明显上调。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示,用Wnt3a刺激后,Si EBP50/MCF-7细胞组体外迁移和侵袭能力明显增强,MDA231/EBP50细胞组体外迁移和侵袭能力明显减弱。Western印迹结果显示,与未用Wnt3a或同时用Wnt3a和抑制剂Dkk1刺激的相比,Si EBP50/MCF-7细胞组上皮-钙粘蛋白(Ecadherin)下调,波形蛋白(vimentin)上调,细胞核中β-联蛋白(β-catenin)的表达水平升高,而MDA231/EBP50细胞组上皮-钙粘蛋白上调,波形蛋白下调,细胞核中β-联蛋白表达下降。上述结果表明,EBP50通过Wnt3a/β-catenin信号通路影响β-联蛋白的转核,抑制EMT的发生,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白激活NF-κB通路诱导神经元细胞炎性焦亡

乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是黄病毒科,单股正链RNA病毒,JEV感染主要引起中枢神经系统炎性损伤。细胞焦亡（pyroptosis）是一种依赖于胱天蛋白酶的炎性细胞程序性死亡。非结构蛋白1(NS1)是黄病毒科类病毒与宿主相互作用的重要蛋白,在病毒的复制、致病及免疫逃逸过程中起关键作用。为了阐明NS1蛋白是否影响JEV诱导的神经元细胞炎性焦亡及其作用机制,本研究以神经元细胞SH-SY5Y为研究对象,以转染pcDNA3.1空载质粒为对照组、转染pcDNA3.1-NS1为实验组进行实验。结果表明,与转染pcDNA3.1空载质粒组相比,转染pcDNA3.1-NS1组中JEV的病毒载量、焦亡相关因子NLRP3、Caspase1、IL-1β及IL-18基因的表达量显著上升,并且与转染pcDNA3.1空载质粒组相比,转染pcDNA3.1-NS1处理组中p-P65/P65蛋白的表达量显著上调,p-IκBα/IκBα蛋白的表达量显著下调,表明NS1蛋白能激活细胞中NF-κB信号通路。随后使用NF-κB激动剂LPS及NF-κB抑制剂BAY 11-7082探...     

乙肝病毒X蛋白通过NF-κB通路调节肝癌细胞迁移、侵袭的研究

慢性乙肝病毒感染是亚洲国家肝癌的常见病因,乙肝病毒所表达的乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)是肝癌发生发展的重要推动因子。核因子-κB(Nuclear factorκB,NF-κB)是模式识别受体下游重要的转录因子,肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)/c-Met途径能够促进NF-κB活化,并通过活化的NF-κB来调节肝癌细胞的迁移、侵袭等生物学环节。但HBx是否直接通过NF-κB通路来调节肝癌细胞的迁移、侵袭尚未明确。为探究HBx通过NF-κB通路调节肝癌细胞迁移、侵袭的作用,本研究采用培养肝癌HepG2细胞并分组,空白对照组用不含药物及质粒的DMEM处理,空白质粒组转染1.2μg的pcDNA3.1空白质粒,HBx质粒组转染不同浓度的HBx表达质粒pcDNA3.1-HBx,HBx+PDTC组转染1.2μg的HBx表达质粒pcDNA3.1-HBx并用含有50μmol/L PDTC的DMEM进行处理;皮下注射HepG2细胞建立移植瘤小鼠模型,称量移植瘤的质量。检测细胞迁移及侵袭活力、细胞及移植瘤中NF-κB通路分子、迁移基因、侵袭基因的表达。结果显示,与空白对照组、空白质粒组比较,HBx质粒组细胞中NF-κB、HGF、c-Met、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平及相对愈合面积、侵袭数目均明显增多(P0.05);与HBx质粒组比较,HBx+PDTC组细胞中NF-κB、HGF、c-Met、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的蛋白表达水平及相对愈合面积、侵袭数目均明显减少(P0.05);与空白对照组、空白质粒组比较,HBx质粒组移植瘤的质量及移植瘤中NF-κB、HGF、c-Met的蛋白表达水平明显增加(P0.05)。本研究得出结论,HBx能够促进肝癌细胞的迁移、侵袭,且该作用与激活NF-κB通路有关。     

调控睾丸支持细胞增殖和分化的信号通路研究进展

支持细胞是睾丸内的一类重要细胞,能为生精过程提供转运蛋白、调节蛋白、生长因子等数十种细胞因子,参与生精细胞成熟分化的调控,对睾丸内各级生殖细胞的迁移、增殖和分化具有重要的支持作用。研究表明,在Wnt/β-catenin信号通路中,关键蛋白β-catenin的适度激活能促进睾丸支持细胞的增殖、分化;在mTOR信号通路中,mTOR基因的缺失导致睾丸支持细胞的数量减少;在TGF-β信号通路中,不同浓度的TGF-β细胞因子影响睾丸支持细胞的增殖、分化。由此可见,Wnt/β-catenin信号通路、mTOR信号通路和TGF-β信号通路在睾丸支持细胞的增殖和分化中均具有重要的调控作用。对这三条信号通路调节支持细胞增殖分化的机制以及它们之间的相互作用作一综述,旨在为深入研究调控睾丸支持细胞增殖的信号机制提供理论依据,从而进一步为雄性生育的调控及生殖方面的疾病治疗提供新思路和新方法。     

HPV16 E6通过影响外泌体中β-联蛋白和紧密连接蛋白1表达促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭

为探讨人乳头瘤病毒16(human papillomavirus 16,HPV16)E6癌蛋白对宫颈癌细胞的生物学行为及外泌体中β-联蛋白(β-catenin)和紧密连接蛋白(claudin-1)表达的影响，本研究利用RNA干扰技术建立HPV16 E6敲低细胞模型(shE6组),通过CCK8试剂盒、流式细胞仪、划痕实验和Transwell实验对细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭特征进行检测，发现shE6相对于对照组(NC组),细胞增殖速率减慢、细胞周期阻滞在G₀/G₁期向S期的过渡阶段，细胞迁移能力显著降低，侵袭能力下降。同时提取细胞上清液中外泌体，利用Western印迹对β-联蛋白和紧密连接蛋白-1表达量进行检测，发现相对于NC组，shE6组细胞内β-联蛋白表达量减少，但外泌体中β-联蛋白量增加，紧密连接蛋白-1在细胞内和外泌体中均增加。上述结果提示，HPV16 E6促进细胞恶性表型可能与E6蛋白能够抑制β-联蛋白以外泌体形式释放，从而增加其在细胞内的积累，以及抑制紧密连接蛋白-1在细胞内和外泌体中的积累有关。     

HPV16 E6对HeLa细胞中Rap1GAP蛋白水平下调的研究

目的探讨HPV16E6对细胞中Rap1GAP蛋白水平的影响,为阐明宫颈癌发生发展的分子机制提供实验依据。本研究组前期实验显示,宫颈癌石蜡切片组织中Rap1GAP蛋白水平下降,且与高危型HPV16/18感染相关。本文将进一步探讨HPV16 E6是否导致Rap1GAP蛋白下调的原因。方法通过将HPV16 E6基因插入pGEX-KG的BamHI和Hind Ⅲ酶切位点构建GST标记的HPVE6质粒,采用脂质体转染法将其转染入HeLa细胞中,Westernblot方法观察GST-tagged-HPV16 E6在HeLa细胞中的表达,并观察其对HeLa细胞中内源性Rap1GAP蛋白水平的影响。结果测序表明成功构建GST标记的HPV16E6质粒;Western blot检测表明HPV16E6在HeLa细胞中成功表达;并且发现HeLa细胞中过表达HPV16 E6后,Rap1GAP蛋白相对含量(0.602±0.205)明显低于未转染组(1.130±0.163),差异具有统计学意义(P0.05)。结论HPV16 E6下调Rap1GAP蛋白水平。     

HPV6L1/CtMOMP多表位融合基因在COS-7细胞的表达及其在小鼠的免疫效果观察

研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b结构蛋白L1(HPV6b L1)基因佐剂增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位(Ct MOMP168)DNA疫苗的免疫效果的可能性.构建pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168融合重组质粒,转染COS-7细胞,用RT-PCR、激光共聚焦显微技术及Western印迹技术检测其表达.分别用pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168、pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168及pcDNA3.1(+)质粒肌肉免疫BALB/c小鼠,ELISA检测外周血中IgG及阴道分泌物中sIgA.结果表明,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CtMOMP168可在COS-7细胞中表达;Ct MOMP168组和HPV6b L1/Ct MOMP168组均可刺激小鼠产生抗Ct MOMP特异性的抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,且HPV6b L1/Ct MOMP168组小鼠产生的抗体滴度明显高于Ct MOMP168组(P0.05).结果提示,分子佐剂HPV6b L1与CtMOMP多表位基因融合能够显著增强Ct MOMP多表位DNA疫苗的体液免疫应答.     

人乳头瘤病毒16E6基因通过增加HMGB1表达调节口腔癌CAL27细胞侵袭的实验研究

人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)感染与口腔癌、宫颈癌的发病有关,HPV16 E6基因编码的蛋白是重要的癌蛋白,已经被证实能够通过增加高迁移率族蛋白B1(High mobility group box-B1,HMGB1)表达来促进宫颈癌细胞的侵袭,但是否能调控口腔癌细胞的侵袭仍未明确。为研究HPV16 E6基因通过增加HMGB1表达调节口腔癌CAL27细胞侵袭的作用,口腔癌CAL27细胞被分为对照组、空白质粒组、HPV16 E6质粒组、NC-si RNA组(短片断干扰RNA阴性对照组)、NC-si RNA+HPV16 E6质粒组、HMGB1-si RNA+HPV16E6质粒组,检测细胞中HPV16 E6及HMGB1的表达、细胞的侵袭数目、培养基中HMGB1的含量。结果显示,HPV16 E6质粒组细胞中HPV16 E6及HMGB1的表达量、培养基中HMBG1的含量、细胞的侵袭数目均高于对照组及空白质粒组(P<0.05);HMGB1-si RNA组细胞中HMGB1的表达量明显低于对照组及NC-si RNA组(P<0.05);NC-si RNA+HPV16 E6质粒组的细胞侵袭数目均明显高于NC-si RNA组(P<0.05),HMGB1-si RNA+HPV16 E6质粒组的细胞侵袭数目均明显低于NC-si RNA+HPV16 E6质粒组(P<0.05)。本研究提示,HPV16 E6基因能够促进口腔癌CAL27细胞的侵袭且这一作用与增加HMGB1表达有关。     

β-catenin基因在人骨肉瘤MG63细胞系的表达变化

目的:观察分析β-catenin基因在人骨肉瘤MG63细胞系的表达变化。方法:培养MG63细胞株,用不同浓度的Wnt3a蛋白或相同浓度、不同时间段的Wnt3a蛋白刺激液MG63细胞生长,用FQ-PCR在m RNA水平检测β-catenin在MG63细胞系的表达变化。培养MG63细胞株,用相同浓度的Wnt3a蛋白刺激,比较刺激组与空白对照组的细胞数目的差别。结果:在细胞生长的第0,1天两组的MG63细胞数量对比没有统计学差异(P0.05);而在第2,3,4天对照组细胞增殖速度较刺激组缓缓,经比较(t=4.109,3.892,5.215,均P0.05)。β-catenin基因表达不会因为Wnt3a的浓度增加而增加。100 ng/m L的Wnt3a蛋白刺激β-catenin基因表达最高,其他几个浓度的β-catenin基因表达对比没有统计学差异(P0.05)。在100 ng/m L的Wnt3a蛋白刺激下,β-catenin基因表达会随时间延长而增加,6 h时β-catenin基因表达最高(P0.05),随后β-catenin基因表达则没有统计学差异(P0.005)。结论:Wnt蛋白对MG63细胞有正向增加增殖作用。激活Wnt/β-catenin信号通路能促进MG63的细胞增殖。     

LY294002对CML急变期细胞中Wnt／β-catenin信号通路的影响及其效应

β-catening在慢性粒细胞白血病急变过程中发挥着重要作用,而其受BCR／ABLTL其下游信号通路调控的具体分子机制尚未完全阐明。该研究旨在探讨PI3K-AK聪号通路对慢粒急变期细胞的影响及其对Wnt／β-catenin信号通路的调控作用。采用P13K-AKT信号通路的靶向抑制剂LY294002作用于慢粒急变期K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖的影响,甲基纤维素克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,Western blot检测pAKT（Thr308）的表达变化,RT-PCR和Western blot分别检测β-catenin及其下游靶基因c—myc、cyclinD1的mRNA和蛋白表达情况。结果显示,10,20,40μmol/L的LY294002作用细胞24h后,抑制了K562细胞的增殖以及克隆形成能力。该效应呈浓度依赖的方式。3种浓度的LY294002处理细胞后,PI3K—AKT信号通路明显被抑制,pAKT（Thr308）的蛋白表达明显减少;β-catenin的mRNA表达无明显改变,但其蛋白水平依次减少;β-catenin的下游靶基因c-myc、cyclin D1的mRNA和蛋白水平均明显降低。综上所述,抑制PI3K-AKT信号通路可抑制白血病K562细胞的增殖和克隆形成能力,其机制可能与抑制Wnt／β-catenin信号通路相关。     

miRNA-145-5p调控FMNL2基因对口腔鳞癌干细胞增殖、迁移的影响

摘要 目的：分析miRNA-145-5p调控形成素2（formin-like 2,FMNL2）基因对口腔鳞癌干细胞增殖、迁移的影响。方法：按照脂质体2000说明书对细胞进行转染miRNA-145-5p inhibitor及miRNA-145-5p mimics,按照实验设计,将其分为空白组、沉默组（miRNA-145-5p inhibitor）及过表达组（miRNA-145-5p mimics）。荧光定量PCR法检测miRNA-145-5p、FMNL2表达量,MTT检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Western blot法检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达量。结果：过表达组miRNA-145-5p、Bax蛋白表达量,凋亡率,细胞G0/G1比例高于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）;过表达组口腔鳞癌干细胞增殖率,FMNL2表达量、MMP-13、β-catenin、Bcl-2、APC蛋白表达量低于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）;过表达组口腔鳞癌干细胞迁移能力弱于沉默组,具有统计学差异（P＜0.05）。结论：miRNA-145-5p通过靶向调控FMNL2,作用于Wnt/β-catenin信号通路调控口腔鳞癌干细胞,进而抑制细胞增殖、迁移。