鸭肠炎病毒UL6基因的分子特征

为了研究鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)UL6的特征,以DEV Clone-03株基因组DNA为模板,用靶基因步移PCR方法扩增得到UL6基因区域2534 bp的DNA片段。结果发现,DEV Clone-03 UL6基因由2373个核苷酸组成,编码一条790个氨基酸残基组成的多肽。与14株已报道的具有全UL6同源基因序列的疱疹病毒参考株进行比较,DEV Clone-03株与α疱疹病毒的核苷酸和氨基酸同源性较之与β疱疹病毒和γ疱疹病毒要高。氨基酸序列比较显示,DEV Clone-03 UL6基因具有α疱疹病毒UL6同源基因5个保守区域。UL6基因推导的氨基酸系统发育进化树分析发现,DEV Clone-03与α疱疹病毒属一个群,在α疱疹病毒中与马立克氏病病毒(Marek′sdisease herpesvirus,MDV)更接近。同时,序列分析发现,在201~222和425~441等氨基酸位,α疱疹病毒参考毒株均有不同程度的缺失,而DEV Clone-03表现出独有的完整性。     

鸭肠炎病毒感染鸭脾脏的转录组分析

为探明鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)感染鸭脾脏的转录组情况,本研究以DEV GZ株经腿部肌肉接种50d鸭,于接种后66h采集鸭脾组织样本,提取总RNA,采用Illumina HiSeq 2000TM对试验组和对照组样品进行测序,筛选DEV感染鸭脾脏组织的差异表达基因,对其进行生物信息学GO功能分类和KEGG信号通路分析。结果显示,差异表达基因共511个,其中表达上调312个,表达下调199个。GO功能分类结果显示,差异表达基因主要涉及氧运输、整合素活化、补体激活等生物学过程,胞外区、血红蛋白复合物、细胞外间隙等细胞组分,氧转运活动、氧结合、核糖体的结构成分等分子功能。KEGG分析表明这些差异表达基因参与ECM受体相互作用、核糖体、CAMs、JAK-STAT信号通路、细胞因子和细胞因子受体相互作用、PPAR信号通路、神经活性配体/受体相互作用信号通路。本研究为深入探究DEV与鸭脾脏组织互作、宿主抗病机制及相关功能基因的筛选奠定了基础。     

几种PCR方法在克隆鸭肠炎病毒未知基因中的应用

以DEV基因组DNA为模板, 用简并PCR、改良Targeted gene walking PCR、改良的热不对称交错PCR和Long-PCR, 获得了5350 bp、11083 bp和2905 bp三段DEV未知基因片段, DNA序列分析发现包含9个开放阅读框, 将这些序列提交GenBank分别获得的登录号为: EF554396~EF554403。结果表明, 多种PCR方法联合使用可以高效的实现对鸭肠炎病毒未知基因的克隆。     

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白受体的筛选与鉴定

为进一步阐明鸭肠炎病毒(DEV)致病机理,本研究通过构建DEV感染鸭肝组织cDNA文库及其文库质粒和DEV核衣壳蛋白(NP)基因"诱饵"质粒,利用酵母双杂交系统筛选DEV NP互作蛋白(受体)基因,并采用GSTpull-down试验进行验证,结果显示:所构建鸭肝组织cDNA文库的库容量为1×106 CFU,插入片段大小集中在0.5～1kb;"诱饵"质粒pGBKT7-NP无自激活现象;筛选并初步证实DEV NP在鸭肝组织细胞的受体蛋白为蛋白激酶C抑制蛋白(PKCI)。这些结果为进一步研究DEV致病机理提供新的线索。     

鸭肠炎病毒CHv强毒株超微结构研究

将鸭成纤维细胞培养的鸭肠炎病毒(DEV),经超声处理、高速冷冻差速离心后,采用酒石酸钾—甘油非线性密度梯度超速离心,收集病毒蛋白带,3%磷钨酸负染后观察病毒粒子形态。结果表明:病毒粒子主要集中在40%~50%酒石酸钾—甘油缓冲液交界层。电镜下,病毒粒子纯净,具有疱疹病毒典型形态结构,剖面六角,外观轮廓清楚。成熟病毒粒子直径约150~266nm,病毒囊膜、核衣壳和核心清晰可见;囊膜外层较内层着色略深,且可见尚未形成完整囊膜的柄状拖尾结构。多数病毒粒子以单核衣壳为主,一定数量的病毒具有双核衣壳,偶见三核衣壳,核衣壳直径为100~150nm,呈现致密圆形、半圆形或马蹄形等类型。在核衣壳外和囊膜之间可见明显的亮晕。核心DNA电子染色较深,集中分布,直径40~65nm。本文获得的清晰DEV负染超微结构照片,为该病毒结构生物学的研究提供了重要依据。     

DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体,采用PCR技术扩增出DEV-NP基因,克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,以PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用PEG/LiA.法将阳性质粒pGBKT7-NP转化酵母Y2HGold,在不同营养缺失型培养基进行自激活检测,结果显示,经PCR检测和EcoR I/BamH I双酶切,可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含DEV NP基因全部序列;转化Y2HGold酵母菌后,在SD/-Trp/X-a-Gal 固体培养基上长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/X-a-GaUAbA固体培养基上未见有菌落生长.无自激活作用的诱饵载体pGBKT7NP的成功构建,为DEV NP宿主结合蛋白的筛选莫定了基础.     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

鸭病毒性肠炎病毒强毒株的形态发生学与超微病理学研究

应用透射电镜和超薄切片技术,研究鸭病毒性肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)CH强毒株人工感染成年鸭后,病毒在宿主细胞内的形态发生及各组织器官的超微结构变化.结果表明,感染后不同时间剖杀及发病后死亡鸭的肝、肠、脾、胸腺、法氏囊等组织器官中,均观察到典型的疱疹病毒粒子.病毒主要的靶细胞为淋巴细胞、网状内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肠道上皮细胞、肠道平滑肌细胞和肝细胞等.DEV的核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型四种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式.病毒核衣壳可在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;也可通过内外核膜进入胞浆,在其中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒释放到细胞外.伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密病毒核酸颗粒、微管和中空短管以及胞浆内膜包裹的电子致密小体、双层管等病毒相关结构.超微研究表明,组织细胞有坏死和凋亡两种变化.坏死细胞肿胀甚至破裂,线粒体肿胀空泡化,粗面内质网扩张,核糖体脱落,有的细胞器甚至完全崩解,染色质或固缩或溶解.凋亡细胞则染色质聚集,胞浆凝聚深染,细胞膜上有大量空泡,并有凋亡小体形成.细胞坏死与凋亡往往同时存在,疾病发生过程中,脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞凋亡数量明显增多.     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

靶向PKCI基因RNAi对DEV增殖的影响

为研究蛋白激酶C抑制蛋白(PKCI)在鸭肠炎病毒增殖的作用机制,根据Gen Bank PKCI基因序列,设计并构建p Silencer-PKCI-l~4,比较后选取抑制效率最高的p Silencer转染DEF细胞,采用荧光显微镜法和FQ-PCR法分析靶向PKCI基因RNA干扰下PKCI基因转录变化。结果显示:p Silencer-PKCI-1~4分别转染DEF细胞,其沉默效率分别为70.01%、66.45%、74.6%和76.02%;p Silencer-PKCI-4转染DEF细胞48 h,对DEV-NP基因转录的沉默效率最高,为64.97%;p Silencer-PKCI-4转染24 h后再感染DEV,在36 h时p Silencer-PKCI-4对DEV-NP基因转录的沉默效率最高,为54.25%;感染DEV 24 h后再转染p Silencer-PKCI-4,再处理72 h时p Silencer-PKCI-4对DEV-NP基因转录的沉默效率最高,为47.83%。本试验结果以期为鸭肠炎病毒核衣壳蛋白的致病机理研究奠定基础,为DEV的防控提供新思路。