从胰岛素A及B链重合成胰岛素 Ⅳ.有关重合成的一些条件

利用二者溶解度的不同可以将无脲条件下拆开的胰岛素初分而得到较纯的S-磺酸型A及B链,再在中性pH用纤维素板电泳可以制得纯的S-磺酸型A链。将经过分离提纯的A及B链按不同比例重新混合还原重氧化结果表明活力恢复程度与A与B链的比例有关,A比B过量对活力恢复有利,A:B=1.5:1时活力恢复最高,可达天然胰岛素的50%左右。本文还对从S-磺酸型A及B链重合成胰岛素最有利的还原及重氧化条件进行了探讨,除其他条件外重氧化的最适pH为10.6。B链单独存在时其还原及重氧化速度均明显地较A链的相应速度为低,但二者共同存在时的还原及重氧化速度却与A链单独存在时相同,表明在溶液中自由A及B链间存在着对恢复活力有重要影响的相互作用,可能是通过次级链作用的相互作用。     

胰岛素及其苄基衍生物在钠-氨系统中的还原及活力恢复

(1)应用三种不同的方法制得了胰岛素苄基衍生物。胰岛素如果用钠-氨还原再与氯化苄作用,可以得到不再有完整二硫键存在的充分苄基化的产物。(2)将胰岛素、S-磺酸型A及B链混合物或者胰岛素苄基衍生物,在钠-氨内还原,然后在稀碱溶液中重氧化,都可以使胰岛素活力再生。用胰岛素或S-B磺酸型A及B链混合物时,经过此处理则活力可以恢复5—10%。用胰岛素苄基衍生物时则一般活力恢复1—2%。(3)从充分苄基化了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实说明可以通过人工合成的A和B链最后合成胰岛素。(4)观察了A和B键混合物巯基氧化和活力再生的过程,并进行了讨论。     

胰岛素A与B链在浓脲溶液中的变化

胰岛素硫-硫键可以用过量的亚硫酸钠与四硫硫酸钠作用而拆开成为S-磺酸型A与B链(以下简称A与B链)。Bailey等在8M脲溶液中用此法拆开蛋白质的硫-硫键,在我们以前的工作中也采用了类似条件。但是脲溶液在浓度较大、温度较高的时候会     

反相高效液相层析在胰岛素结构与功能研究中的应用

采用一种简单的“甲醇-水-0.1％三氟醋酸”作为洗脱体系的反相高效液相层析对研究胰岛素结构与功能关系,以及A链和B链相互作用时所用的一些胰岛素衍生物进行了快速、灵敏、准确的分析和鉴定。 胰岛素的S-磺酸型A链和B链只经一次离子交换层析纯化,经鉴定结果表明是均一的。S-硫甲基型A链和B链基本上也是均一的。通过对胰岛素还原产物的分析确定了能保证胰岛素折分完全并对其重组较为有利的还原条件。去B链羧端五肽(B26—30)胰岛素,以及去B链羧端八肽(B23—30)胰岛素能同时与天然胰岛素清楚地分离。一级结构差别极小的猪胰岛素和牛胰岛素也可得到分辨。胰岛素的羧端缩短的B链和A链重组的定量分析表明B链羧端肽段不但对胰岛素分子的生物活力的体现,而且在A链和B链的正确重组中都起着重要的作用。     

S-磺酸型胰岛素A链的二体

用凝胶过滤法测定胰岛素A 链的分子量,发现当用过量的亚硫酸钠和四硫硫酸钠将胰岛素拆开成S-磺酸型A 及B 链时,A 链以单体和二体两种形式存在。一旦除去亚硫酸钠和四硫硫酸钠,冷冻干燥后,A 链单体大部分转变成二体。将A 链样品长期放置,还会有四体、六体的聚合物出现。将回收的A 链二体透析冻干后,再用四硫硫酸钠及亚硫酸钠处理,A 链二体能拆开成单体,说明A 链单体间以硫硫键相连成二体。     

S-磺酸型胰岛素A链的二体

用凝胶过滤法测定胰岛素A链的分子量,发现当用过量的亚硫酸钠和四硫硫酸钠将胰岛素拆开成S-磺酸型A及B链时,A链以单体和二体两种形式存在。一旦除去亚硫酸钠和四硫硫酸钠,冷冻干燥后,A链单体大部分转变成二体。将A链样品长期放置,还会有四体、六体的聚合物出现。将回收的A链二体透析冻干后,再用四硫硫酸钠及亚硫酸钠处理,A链二体能拆开成单体,说明A链单体间以硫硫键相连成二体。     

还原型胰岛素A、B链相互作用的初步研究

本文报道在chance所用“一步法”重组胰岛素的类似条件下,还原型A、B链相互作用研究的初步结果。在pH10.6对S—磺酸型A及B链加入1.2倍SH/SSO_3—的二巯基苏糖醇,在一小时内A、B链与DTT的混合物较之单独的A、B链与DTT的混合物,紫外差光谱显示295、245nm负差峰,峰值随时间增大;园二色性测定观察到混合链的α螺旋含量比单独的A、B链有所增加。这表明在A、B链的巯基氧化生成二硫链前,还原型A、B链间的相互作用导致Tyr残基逐渐内埋,肽链构象的调整使有序二级结构增加。根据此时还原程度的测定,讨论了DTT与S—磺酸型A、B链作巯基交换的可能机制,过多的还原试剂易破坏已正确配对的二硫键,也妨碍肽链构象的调整。     

S-硫甲基型胰岛素A及B链相互作用的200MHz~1H NMR研究

前已报道,S-硫甲基型胰岛素A及B链相混后,α螺旋等有序二级结构含量增加,部分酪氨酸残基由相对亲水的环境逐渐转移到相对疏水的环境,整个过程在1.5～2小时达到稳定,说明在还原型A、B链能重组成有活力的胰岛素的相同条件下,两肽链间确实存在着次级键相互作用。本文报道以200兆赫NMR~1H谱所测S-硫甲基型A及B链的图谱,对其主要谱峰作了初步识别。在pH10.8时,A及B链以克分子比1.5:1相混后,Tyr的(2,6)位及(3,5)位质子峰较之单独链有低场位移,提示Tyr的酚羟基解离减少,Tyr转移至相对疏水的环境;也可能是肽链构象变化,使Tyr受去屏蔽效应所致。在A、B链相混后,每半小时累加的结果表明,不仅Tyr的两个低场峰随时间有低场位移,甲基峰随时间也有连续的低场位移,在1.5小时后达到稳定。此时间过程与前者报道的紫外差光谱、园二色性的观察结果一致,说明构象的调整涉及整个肽链。不同pH下的~1H谱测定显示,在一段pH区间都存在着A、B链间的次级键相互作用。上述结果表明,或许正是这种链间的次级键相互作用,才使A、B链之巯基有可能正确配对,重组成有生物活力的胰岛素分子。     

从胰岛素A及B链重合成胰岛素 Ⅲ.活力恢复水平的进一步提高

本文进一步改进了从A及B鏈重合成胰島素时的某些条件,如避免使用脲、控制还原温度及时間、改进沉淀还原产物时的pH使还原型A及B鎚的回收更为完全,以及控制重氧化时的温度等,最后胰島素活力恢复水平可以达到原活力的50%左右。同时我們观察了拆开胰島素三个硫硫鍵时其生物活力丧失的过程,初步认为胰島素的必需硫硫鍵数是二个。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C端片段除“工”字肽的免疫活力比A链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N端区域比C端重要。同样,B链可能比A链重要。     

胰岛素片段与胰岛素抗体的相互作用

本文研究了若干胰岛素片段及去B链C端八肽胰岛素(DOI)、A链、B链与胰岛素抗体的结合能力。结果表明N 端区域片段保留部分胰岛素的免疫活力,而C 端片段除“工”字肽的免疫活力比A 链略高外,其他片段(B_(26～30),B_(22～26))均和A 链类似,没有胰岛素的免疫活力。以上结果进一步说明在免疫活力方面,胰岛素分子的N 端区域比C 端重要。同样,B 链可能比A 链重要。     

磺酸型及还原型胰岛素A链、B链的低场~1H-NMR谱峰的初步识别

以Varian-XL400核磁谱仪对磺酸型及还原型A链、B链在pH10.76时的低场~1H-NMR谱峰作了初步识别,指出它们的分辨率大大高于S—硫甲基型A链、B链谱峰的分辨率。并研究了十二烷基磺酸锂(LDS)对它们的影响。LDS的疏水尾部使酪氨酸受到疏水基因的屏蔽作用,导致峰值向高场位移。     

用NMR法分析胰岛素的新型活性结构

美国哈佛大学医学部Q.X.Hua小组用核磁共振法(NMR)测定人胰岛素及其衍生物在溶液中的结构,并发现胰岛素并非是目前由x线结晶分析确定的结构(闭锁型,结合于受体),而是由非闭锁型起作用。Hua等推测:天然型结合于受体时在某种作用下变化成非闭锁型,受体结合部位为A链的N末端的2个疏水基。目前,x线结晶分析不能观察这种非闭锁型的结构。胰岛素的结构含21个氨基酸残基的A链和30个残基的B链,由2个二硫链搭接而成。被Hua称为闭锁     

胰岛素结构与功能关系的研究——Ⅳ.B_(22)-精氨酸的改变对胰岛素生物活性的影响

本文叙述了一系列B_(22)-精氨酸改变的B_(23)-D-Ala去B链羧端六肽胰岛素类似物的半合成。半合成途径是胰岛素六甲酯(INS-OMe)经胰蛋白酶和羧肽酶B作用得到去B链羧端九肽胰岛素五甲酯OMe-(DNIOH),A_1和B_1的α-氨基用Boc-基保护后与X-D-Ala·PheOMe(X=Gly,D-Arg,Val,Arg,Boc-Lys和OTB-Asp)缩合,三氟乙酸和皂化去除所有的保护基。这些类似物的生物活力表明;B_(22)-Arg并非不能改变,它用Lys甚至Asp代替后,不影响活力,活力水平约为天然胰岛素的20%。当B_(22)-Arg用Val代替后活力降低一半,而用Gly或D-Arg代替后,活力很低。文中对B_(22)-Arg在维持胰岛素构象和对胰岛素生物活力的影响以及豚鼠胰岛素活力低的原因等问题进行了讨论。     

去七肽胰岛素的分子动力学研究

本文用分子动力学的方法对去七肽胰岛素(DHPI)分子的构象进行了研究,首先用分子动力学方法对晶体胰岛素分子的构象能进行了优化,然后除去B链C端的最后七个残基(B24—B30),做分子动力学模拟,得到了DHPI的平衡构象和均方差波动。胰岛素分子的X射线晶体衍射结构和能量优化构象之间的均方根偏差为0.1;所得DHPI构象和胰岛素能量优化构象间C原子间的均方根偏差为1.8。变化最大的区域是A8—A10,A18—A21,B1—B41和B18—B23。     

S-磺酸型胰岛素B链的直线聚合作用 Ⅲ.S-磺酸型胰岛素B链的一些性质

前此报导,S-磺酸型胰島素B链(以下簡称B鏈)具有直綫聚合的性貭,并曾对其聚合过程进行了初步研究。为了进一步了解此聚合过程的机制,需要对B鏈单体的构型和其它性貭有所了解。关于氧化的磺酸型B鏈的性貭,文献中有一些报导。經重氢交换測定,此系一稍具螺旋結构的大肽。至于S-磺酸型B链,前此根据其旋光值判断,也具有一些螺旋构型。     

胰岛素B鏈中肽段的合成 Ⅸ.胰岛素B鏈的合成及其与天然A鏈重组合后胰岛素活力的恢复

有关胰岛素A及B鏈中肽段的合成工作已在好几家实验室进行。最近,Katsoyannis等用简报方式报导了A及B链的合成,并分别和天然的B及A组合后所得的产物能表现出约0.5—1.0%的胰岛素活力。Meienhofer等也报导了A及B链的合成并指出了两条肽链衍生物的混合物经钠-液     

用半合成方法证明B_(22)-精氨酸不是胰岛素表现活性所必需的

胰岛素六甲酯经胰蛋白酶和羧肽酶B水解,得去B链羧端九肽(B_(22-30))胰岛素五甲酯的两个α-氨基用叔丁氧羰酰(BOC)保护后与X-D—Ala—PheOMe(X=Arg,D-Arg,Gly,Lys或Asp)缩合,去除所有的保护基后得B_(22)改变的去B链羧端六肽胰岛素(D-Ala~B_(22)-DHI)。这些类似物的生物活性表明:Arg~B_(22)能为Lys或Asp代替,这结果说明Arg~B_(22)不是胰岛素活力所必需。但Arg~B_(22)若为D-Arg或Gly代替,活力很低。     

B27K—去B链C端三肽胰岛素的制备、生物活力与自聚合性质

液相合成五肽Gly Phe Phe Tyr Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B2 7K 去B链C端三肽胰岛素(B2 7K DTrI,B2 7K destripeptideinsulin)。用小鼠惊厥法和小鼠降血糖法测得B2 7K DTrI的整体生物活力为标准胰岛素的 80 % ,B2 7K DTrI与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的 ( 12 5± 13 ) %。用凝胶过滤法证明B2 7K DTrI自聚合性质降低 ,具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B2 7K DtrI结构中 ,B2 7T被K取代 ,其优点是在酵母中表达其前体后 ,可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得     

去B链羧端五肽胰岛素的结构研究——Ⅰ.制备及性质

本文报道了一种改进的去B链羧端五肽胰岛素(DPI)的制备方法。按此法可获适宜单晶培养用的DPI制剂。其结晶制剂的受体结合活力为胰岛素的88%。其小白鼠惊厥活力为20I.U./毫克。在Zn~( )存在下和胰岛素有免疫交叉反应。