糙皮侧耳生长发育过程中漆酶基因家族的表达研究

漆酶参与木质素的降解和食用菌的生长发育。为了明晰漆酶基因在糙皮侧耳生长发育过程中的作用,本文采用real-time PCR检测了11条漆酶基因及Lacc2的小亚基sspoxa3在糙皮侧耳生长发育不同阶段的表达。其中lacc6和sspoxa3在整个生长发育阶段表达量均较高;lacc12随着原基的分化和子实体的形成大量表达,与成菇过程有关。lacc4,lacc7和lacc11在原基分化期高表达,与原基的分化有关。lacc2,lacc3和lacc8在成熟子实体阶段表达量显著上升,与子实体的分化和成熟有关。     

糙皮侧耳乙醛脱氢酶基因PoALDH1的克隆与非生物胁迫下的表达分析

本研究从糙皮侧耳中克隆了乙醛脱氢酶基因PoALDH1(Gen Bank登录号为KT026035)和其全长c DNA序列。长为2 016bp的PoALDH1序列编码478个氨基酸,分子量约为52k Da,氨基酸序列中含有乙醛脱氢酶保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。PoALDH1基因在大肠杆菌中表达后显示,重组菌株的乙醛脱氢酶比活力为0.58U/mg,且重组菌株的乙醛耐受性显著高于对照菌株。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)分析PoALDH1基因在糙皮侧耳不同发育时期的表达结果显示,PoALDH1基因在原基期的表达量约为双核菌丝期的5倍。PoALDH1基因在原基发育起始阶段经光照及温差刺激后均上调表达。当糙皮侧耳菌丝暴露在不同浓度的氯化钠及甘露醇的条件下时,菌丝生长均受到抑制且PoALDH1基因的表达量均高于对照。研究结果将为进一步从分子水平揭示糙皮侧耳的抗逆机制以及食用菌的发育奠定一定基础。     

糙皮侧耳原基期差异表达基因分析

为解析糙皮侧耳原基期与菌丝期差异表达的基因,本研究以原基期cDNA为检测子（tester）、双核菌丝期cDNA为驱赶子（driver）,采用抑制性消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH）构建了糙皮侧耳SSH cDNA文库。菌液PCR验证SSH cDNA文库插入cDNA片段后,挑取了2 055个差异转化子,差异转化子经3次反向Northern杂交筛选,得423个信号差异显著的克隆;阳性克隆测序后,经NCBI数据库Blastn和Blastx比对,共得206条差异表达序列（expressed sequence tag,EST）,重复序列去除后,有46个基因参与了细胞急救和防御、能量代谢、转录和蛋白调控、膜蛋白和信号转导,18个基因编码未知功能的推定蛋白,5个无任何同源性的新基因。挑取10个差异表达基因进行半定量RT-PCR,发现这些序列在原基期的表达水平显著高于菌丝期。结果表明,本研究成功构建了糙皮侧耳原基期与菌丝期SSH cDNA文库,为进一步分离糙皮侧耳生长发育相关基因并研究糙皮侧耳的发育机制奠定了基础。     

信息素信号通路基因在斑玉蕈生长发育过程中的差异表达

为了更清楚地了解斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育的过程,本研究对不同菌丝培养时期的栽培瓶进行出菇实验,并对其不同培养时期和生长发育关键时期的信息素通路基因进行差异表达分析,以期揭示信息素信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体形成和发育的作用。研究结果表明：斑玉蕈菌丝培养40-80d过程中,子实体产量呈上升的趋势,说明菌丝的成熟程度对产量会产生重要影响。对斑玉蕈基因组中的信息素信号通路基因进行分析鉴定共获得了8个关键基因。信息素通路基因差异表达分析表明：在菌丝培养40-80d过程中,大部分信息素信号通路基因在第60天时表达量最高,其中ste20、cdc24和ste12上调了4-20倍,而在第80天出现下降。从菌丝恢复到扭结形成原基和子实体发育的过程中,大多数基因在原基时期表达量最高,其中ste20、cdc24、ste11和ste12表达量上调最为显著,在子实体成熟期这些基因表达量下降。因此,这说明在菌丝营养生长过程中,在第60天菌丝细胞增殖生长最为旺盛,而在第80天菌丝细胞基本停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时,在菌丝生殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调信息素通路基因表达使菌丝细胞不断地分裂增殖,从而使新生的菌丝扭结形成原基,其中ste3、ste20、cdc24、ste11和ste12基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和诱导子实体形成起到关键的作用。     

热胁迫对糙皮侧耳抗霉菌侵染能力的影响

糙皮侧耳Pleurotus ostreatus具有较高的食用与药用价值,是世界上广泛栽培的食用菌之一,也是中国栽培范围最广的食用菌。糙皮侧耳生产中会受到多种环境因素的影响,其中温度是最重要的环境因子。为了探究高温对糙皮侧耳生理及抗霉菌侵染能力的影响,以生产菌袋为材料,分离并获得3种霉菌,经鉴定为卷枝毛霉Mucor circinelloides、四孢脉孢菌Neurospora tetraspora和长柄木霉Trichoderma longibrachiatum;进一步研究发现,高温显著抑制糙皮侧耳菌丝生长,高温胁迫后,糙皮侧耳抗霉菌侵染的能力降低、微观结构遭到破坏、糙皮侧耳菌丝胞外多糖含量显著增加并且吸附霉菌孢子的能力增强。本研究为阐明高温降低糙皮侧耳霉菌感染抗性的作用机制提供科学依据。     

CWI和HOG信号通路基因在斑玉蕈不同发育阶段的表达模式

为了更清楚地了解MAPK信号通路中的细胞壁完整性信号通路（cell wall integrity,CWI）和高渗透压甘油（high-osmolarity glycerol pathway,HOG）信号通路对斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育过程的影响及调节作用,对MAPK信号通路中的CWI和HOG信号通路基因在斑玉蕈不同菌丝培养时间（40、60、80和100d）和不同生长发育关键时期（24h、菌丝恢复期、菌丝转色期、原基期和子实体期）的表达模式进行分析,以期揭示这两条信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体的形成和发育的作用。在斑玉蕈的CWI和HOG信号通路中经分析鉴定一共获得了15个关键基因。CWI信号通路基因表达分析表明：在菌丝培养的40-100d的过程中,大部分CWI信号通路基因在第60天时表达量最高,其中rho1、ssk1、ssk2和ste20的基因表达量上调了2-5倍,在第80-100天时出现持续下降。在HOG信号通路中的大部分基因也在菌丝培养的第60天表达量达到最高。其中sho1、ste20、ssk1和ssk2基因的表达量上调最为显著,而hog1基因的表达量在菌丝培养的第40-100天呈持续下降。子实体形成过程中两条通路的大部分基因在原基形成时期表达量最高,而在子实体时期表达量下调。其中HOG信号通路中的ssk2基因表达量上调最为显著。以上结果说明在菌丝生长过程中第60天时菌丝细胞生长增殖最为旺盛,而在第80天开始菌丝细胞基本开始停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时在菌丝增殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调CWI信号通路基因的表达来调控菌丝细胞壁的完整性,从而控制菌丝细胞壁的形成。其中bck1、mkk1和slt2基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和细胞壁的形成以及诱导子实体形成起到关键作用。     

基于转录组分析高温抑制广东虫草原基形成的调控网络

在大型真菌原基形成和子实体发育的过程中,温度是一个极其关键的因素,高温显著影响多种食用菌原基的形成和子实体的品质。广东虫草是中国华南地区特有的虫草类新食品原料,其子实体富含多种活性成分和营养成分,且能够进行较大规模人工栽培。然而,温度对广东虫草原基形成的影响及调控机制尚不清楚。本研究通过不同温度处理不同时间段,发现29℃处理3d抑制了广东虫草原基的形成;对29℃处理3d处理前后的菌丝阶段（CK）和原基阶段（CK-P和HT-P）样品进行转录组测序分析,高温处理后原基阶段的两个组中发现1 682个差异表达基因,其中1 015个上调表达和667个下调表达。在碳水化合物代谢途径中,多个糖酵解和三羧酸循环及葡聚糖和海藻糖合成相关基因在高温处理后呈现下调表达;在原基样品中,多个热激蛋白基因（Hsp10、Hsp23、DnaJ、Hsp70、Hsp90和Hsp98）和转录因子C2H2转录水平显著上调表达。本研究结果基于分子水平揭示了高温影响原基形成过程中能量代谢和相关基因的差异表达,为后续利用广东虫草抗逆相关基因资源培育新品种奠定了重要的基础。     

硬毛粗盖孔菌过氧化氢酶家族基因鉴定及表达分析

硬毛粗盖孔菌是一种结实能力强的耐热真菌,为了探究其过氧化氢酶(CAT)基因家族的基本特征和功能,分别对不同交配型单核体Ct001_29和Ct001_31基因组的CAT基因家族进行了鉴定,并分析了不同CAT家族基因在不同温度条件下培养的菌丝、原基和子实体中的表达特征。硬毛粗盖孔菌基因组上有3个CAT基因(Ctcat1-Ctcat3),编码510-743个氨基酸;Ctcat1、Ctcat2和Ctcat3的等位基因之间的结构及序列相对保守,但编码区也存在少量SNP变异(6-14个)。在25 ℃培养菌丝和35 ℃培养菌丝、原基及子实体中,35 ℃菌丝的CAT酶活最高,为278 U/mg蛋白,原基期CAT酶活最低,为4 U/mg蛋白。Ctcat2的表达丰度显著高于Ctcat1和Ctcat3,Ctcat1和Ctcat3具有相似的表达模式,在35 ℃菌丝、原基和子实体中均上调表达;而Ctcat2具有相反的表达模式,在35 ℃菌丝、原基和子实体中均下调表达。此外,Ctcat2在原基时期、Ctcat3在25 ℃菌丝和35 ℃菌丝中具有偏好表达,Ct29cat2和Ct29cat3的表达量均高于各自的等位基因。本研究所发现的CAT等位基因表达偏好为进一步揭示大型真菌CAT的基因功能奠定了基础。     

锰离子Mn(Ⅱ)对糙皮侧耳木质素降解酶活性和原基形成的影响

木质素降解酶是糙皮侧耳Pleurotus ostreatus分解木质素的关键酶。本文以糙皮侧耳栽培菌株New831为试验材料,通过固体培养法和液体培养法测定了不同浓度锰离子Mn(II)对其菌丝生长、偶氮染料橙黄II降解率、木质素降解酶活性和原基形成的影响。结果表明,添加Mn(II)可促进糙皮侧耳菌丝生长,GP-Orange液体培养时的最适Mn(II)浓度为50μmol/L,GP-Urea-Orange固体培养时的最适Mn(II)浓度为70μmol/L;添加Mn(II)可加速橙黄II的降解,Mn(II)浓度为70μmol/L时,橙黄II降解率最高、脱色圈最大;漆酶和锰过氧化物酶活性均随Mn(II)浓度增加呈现"先升后降"的趋势,而木质素过氧化物酶活性则随Mn(II)浓度的增加而降低;添加Mn(II)可诱导原基形成,Mn(II)浓度为70μmol/L时,原基数量最多。此外,平板培养结果揭示木质素降解酶活性与菌丝生物量之间无相关性,其主要是在营养限制条件下表达。     

不同碳氮源对糙皮侧耳木质纤维素酶活性的影响

以糙皮侧耳Pleurotus ostreatus为材料,研究简单碳氮源及木质素纯品诱导条件对其木质纤维素酶活性的影响。结果表明,不同的碳源培养基和氮源培养基对糙皮侧耳漆酶活性、羧甲基纤维素酶活性和木聚糖酶活性均具有极显著的影响（P<0.001）,且对糙皮侧耳菌丝生物量也有极显著的影响（P<0.001）。以蔗糖作主要碳源诱导物时,有利于提高糙皮侧耳漆酶活性;以果糖作主要碳源诱导物时,有利于提高糙皮侧耳羧甲基纤维素酶活性和菌丝生物量的积累;以葡萄糖作主要碳源诱导物时,有利于提高糙皮侧耳木聚糖酶活性。以酵母浸粉作主要氮源诱导物时,有利于提高糙皮侧耳漆酶活性和菌丝生物量的积累;以硝酸钾作为主要氮源诱导物时,有利于提高糙皮侧耳羧甲基纤维素酶活性;以硫酸铵作为主要氮源诱导物时,有利于提高糙皮侧耳木聚糖酶活性。碱性木素的存在,有利于提高糙皮侧耳漆酶活性,但不利于菌丝生物量的积累。与此同时,碱性木素的存在对糙皮侧耳羧甲基纤维素酶和木聚糖酶活性并没有促进作用。     

糙皮侧耳不同生长时期发酵料中微生物和代谢物的变化

为了解糙皮侧耳栽培期间发酵料中的微生物及代谢产物变化,分别采用宏基因组测序、非靶向代谢组学技术对糙皮侧耳5个生长时期发酵料中微生物及代谢物进行分析。结果表明：糙皮侧耳生长发育过程中,发酵料中的Bacillus EGD-AK10、Cellulosinicrobium aquatile、Cellulosinicrobium cellulans、Cellulosinicrobium funkei、CellulosinicrobiumKWT-B、CellulosinicrobiumTH-20、Mycobacterium abscessus、Ochrobactrum intermedium 8种细菌的相对丰度与糙皮侧耳相对丰度呈显著正相关关系（P<0.01）,而Pseudoxanthomonas suwonensis和Thermobispora bispora与糙皮侧耳相对丰度呈显著负相关关系（P<0.05）。发酵料中微生物参与了发酵料的代谢,从而导致其中代谢物的变化。主成分分析（principal component analysis,PCA）结果表明,5组发酵料样品之间代谢物具有明显差异。采用正交偏最小二乘判别分析方法（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）从发酵料样品中共筛选和鉴定到100种差异代谢物,含量与糙皮侧耳相对丰度呈显著正相关的代谢物有36种,呈显著负相关的有19种,主要包括糖类、氨基酸、脂类和核苷酸。通过差异代谢物通路分析得到10条具有显著影响的代谢通路。与糙皮侧耳相对丰度呈显著正相关关系的8种细菌的相对丰度与上述36种代谢物的含量之间亦呈显著正相关关系（P<0.05）,意味着发酵料中的微生物、代谢物对糙皮侧耳的生长发育具有显著的影响。通过本研究将加深对细菌-真菌相互作用的了解,有利于食用菌产业的高质量发展。     

早期真菌与本土和外来松的菌根合成

为探讨早期真菌与本土和外来松树的共生特性,选用3种早期外生菌根真菌(环褐乳牛肝菌Suillus luteus、虎皮乳牛肝菌S. phylopictus和酒红蜡蘑Laccaria vinaceoavellanea)接种2种本地松(云南松Pinus yunnanensis、华山松P. armandii)和2种外来松(P. greggii、P. maximartinensis),并对接种后的侵染率、菌根特征和松苗株高等进行测量和分析,结果显示：6个月后,2种乳牛肝菌与4种松均能形成菌根,华山松与2种乳牛肝菌的亲和性最好,酒红蜡蘑仅能与2种外来松P. greggii和P. maximartinensis形成菌根,且菌根合成成功率仅为14.3%。此次合成的10种菌根组合均为首次报道,其中同一种真菌与不同松形成的菌根在形态和解剖特征上较为接近。3种真菌对宿主生长的促进作用因树种而异,整体上外来松苗的生长速率要快于本土松苗;华山松苗虽然菌根感染率最高,但生长效应却均不明显。研究认为：孢子接种对乳牛肝菌、蜡蘑等早期真菌的菌根合成研究是一种经济有效的手段;外生菌根真菌可能对外来树种具有更为重要的作用,与本土树种相比,外来树种与外生菌根真菌在能否形成菌根、菌根形成时间以及对宿主的生长效应等方面存在差异,需要开展进一步深入的相关研究。     

糙皮侧耳脲酶基因的克隆和原核表达分析

尿素是现代农业生产中应用较为广泛的一种氮素化肥,而脲酶（EC 3.5.1.5）是尿素分解利用的关键酶。本文以糙皮侧耳Pleurotus ostreatus栽培菌株New 831为试验材料,探究了糙皮侧耳对尿素的利用情况,结果表明：糙皮侧耳可利用尿素作为唯一氮源,平板培养时尿素最适添加量为20mmol/L;在液体摇瓶培养过程中,培养液中的铵根浓度表现为先急剧升高后缓慢降低。通过对P. ostreatus PC15菌株基因组分析,获得了一个功能注释为脲酶的基因,并克隆获得了其全长基因组DNA（gDNA）和编码区（CDS）片段,命名为Pourease。结果表明：Pourease基因的gDNA和CDS长度分别为3 003bp和2 517bp,由10个外显子和9个内含子组成;Pourease蛋白由838个氨基酸组成,预测分子量为90.03kDa,与SDS-PAGE分析结果相符;Pourease蛋白与细菌、真菌和植物来源的脲酶具有52%-82%的一致性,且含有脲酶保守的镍离子结合位点;与洋刀豆脲酶空间结构类似,Pourease蛋白也以同源三聚体的形式存在。     

查尔酮衍生物对黑曲霉线粒体结构及功能的影响

本研究旨在探讨查尔酮衍生物对黑曲霉线粒体结构和功能的影响,评估查尔酮衍生物对黑曲霉的抗真菌效果。采用不同浓度查尔酮衍生物处理黑曲霉菌丝体,通过透射电子显微镜观察线粒体结构;并进一步对黑曲霉线粒体的活性氧、丙二醛水平、三羧酸循环相关酶活性和线粒体膜电位的变化进行测定。结果表明,查尔酮衍生物以剂量依赖的方式诱导黑曲霉线粒体结构损伤,导致线粒体总脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和ATP酶活性改变,线粒体膜电位降低,丙二醛和活性氧水平显著升高。这些发现表明查尔酮衍生物可以破坏线粒体膜通透性,导致线粒体结构破坏,从而损害线粒体功能,达到抗真菌效果。     

沙地樟子松带状混交林土壤碳氮磷化学计量特征

探究不同沙地樟子松混交林土壤碳氮磷化学计量变化规律,为其混交经营提供科学依据.以沙地樟子松纯林为对照,在沙地樟子松×榆树及沙地樟子松×怀槐带状混交林中,沿沙地樟子松和伴生树种两个方向在距离混交中心0、1、2、3和4 m处的不同土层采集土样,分析土壤有机C、全N、全P、速效N、速效P含量及其计量比的特征.结果表明: 沙地樟子松混交林土壤有机C、全N和速效N含量高于纯林, 沙地樟子松与榆树混交主要增加了深层土壤有机C和全N含量,以及C/N和C/P, 沙地樟子松与怀槐混交提高了土壤N含量, 降低了P含量.随着远离混交林中心,沙地樟子松×榆树混交林中沙地樟子松林带的土壤C/N先升高后降低,全P和速效P含量下降,N/P增加;榆树林带土壤C/N下降,速效P含量先升高后降低.沙地樟子松×怀槐混交林土壤全N含量在沙地樟子松林带先降低后升高,在怀槐林带先升高后降低.沙地樟子松混交林提高了土壤C、N储量,沙地樟子松应与榆树行间混交,与怀槐间隔2行混交.     

金针菇HMG-box转录因子鉴定及一个候选基因的差异表达分析

食用菌的原基形成受到环境因子和内源基因的共同调控,转录因子在其生长发育过程中能够起到关键作用。本研究在已测序金针菇单核菌株L11全基因组中鉴定到29个高速泳动蛋白（high-mobility-group box,HMG-box）转录因子编码基因。基于金针菇双核菌株H1123各发育时期转录组数据,筛选到一个与金针菇原基形成相关的HMG-box转录因子基因Fv-hmg。通过同源比对发现Fv-hmg的DNA序列在6个不同金针菇菌株中十分保守,一致性为98.38%,有92个SNP位点。克隆分析表明,该基因长度为1 517bp,含有一个内含子。该基因编码489个氨基酸残基的蛋白序列,含有一个HMG-box结构域。通过实时荧光定量PCR和转录组测序共同分析表明,该基因在金针菇原基时期的表达量比双核菌丝时期高达4倍以上,具有显著性差异（P<0.01）,由此推测该转录因子参与调控金针菇的原基形成。HMG-box转录因子Fv-Hmg在金针菇原基形成过程中的作用仍需进一步研究。     

陕西榆林沙区樟子松根内真菌群落结构和功能群特征

樟子松Pinus sylvestris var. mongolica是我国北方沙区生态环境建设的重要树种之一,但衰退问题严重。根内真菌与樟子松生长密切相关,可能是影响樟子松衰退的重要因素。为揭示根内真菌群落结构和功能群特征,以陕西榆林沙区中龄（27a）、近熟（33a）、成熟（44a）3个龄组樟子松人工林为研究对象,采用野外调查与分子生物学相结合的研究方法,鉴定分析樟子松根内真菌群落结构和功能群。结果表明：（1）樟子松根尖样品共获得855个OTUs,不同林龄樟子松根内真菌多样性不存在显著差异（P>0.05）。（2）根内真菌隶属于6门18纲48目87科197属,子囊菌门Ascomycota和担子菌门Basidiomycota比例高达97.31%,优势属为青霉属Penicillium和Archaeorhizomyces。（3）随林龄增加,樟子松根系中病理营养型和腐生营养型真菌比例先增加后下降,而共生营养型真菌比例先下降后上升。榆林沙区樟子松根内真菌物种组成丰富,功能群类型多样,外生菌根真菌为主要功能群,近熟林腐生营养型真菌相对丰度高于共生营养型真菌,可能是樟子松退化的潜在原因。