p-CREB在小鼠植入前胚的表达及其与2-细胞阻滞的关系

目的观察p-CREB在小鼠植入前胚以及阻滞品系(昆明小鼠)与非阻滞品系(B6C3F1小鼠)2-细胞胚的分布与表达,初步探讨p-CREB在小鼠植入前胚中的作用以及与小鼠2-细胞阻滞的关系。方法利用激光扫描共聚焦显微镜检测p-CREB在B6C3F1小鼠植入前胚中的定位,比较不同品系小鼠体外培养以及B6C3F1小鼠体外培养与体内发育2-细胞胚内p-CREB的表达变化。结果 p-CREB的免疫阳性反应在小鼠1-细胞胚中主要分布于细胞质中;2-细胞胚及其后期植入前胚主要定位于细胞核内;昆明小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著低于同一条件发育的B6C3F1小鼠,B6C3F1小鼠体外培养2-细胞胚核内荧光强度显著高于体内发育。结论 p-CREB在小鼠植入前胚发育中起重要作用,p-CREB在昆明小鼠2-细胞胚核内表达较低可能与小鼠2-细胞阻滞有关。     

FGF10对小鼠植入前胚体外发育及2-细胞胚内G蛋白偶联受体30表达的影响

目的 观察成纤维细胞生长因子10(FGF10)对小鼠受精卵体外发育和2-细胞胚内G蛋白偶联受体30(GPR30)水平的影响,为进一步探讨FGF10在小鼠植入前胚体外发育中的作用提供依据。方法 以M16培养液为对照组,M16中分别添加不同浓度的FGF10为实验组,收集昆明(KM)雌性小鼠与KM雄性小鼠交配所得的受精卵,分别观察各组受精卵体外发育情况。收集KM小鼠受精卵,分别置于M16和含不同浓度FGF10的M16培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光染色结合激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内GPR30水平。结果 添加FGF10实验组发育到4-细胞胚、桑葚胚和囊胚的比率明显高于对照组,其中以添加浓度为10ng/ml的FGF10实验组的效果最明显。免疫荧光染色结果显示,10ng/ml的FGF10实验组体外发育2-细胞胚内GPR30免疫荧光染色强度明显高于对照组。结论 FGF10可促进KM小鼠植入前胚的体外发育,其作用可能与上调2-细胞胚内GPR30有关。     

人参皂甙Rg1对昆明小鼠早胚体外发育的影响

目的观察人参皂甙Rg1对昆明(kunming,KM)小鼠早胚体外发育的影响,为改善小鼠早胚体外培养体系奠定实验基础。方法以空白M16培养液为对照组,M16中添加浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L Rg1为实验组,收集KM小鼠1-细胞胚进行体外连续培养,计数各组发育至2-、4-细胞胚、桑葚胚和囊胚等各个阶段的数目,比较各组发育至不同阶段的比率。结果添加Rg1实验组发育到桑葚胚和囊胚的比率明显高于对照组,其中以添加浓度为10μmol/L的Rg1实验组的效果最显著,其桑葚胚发育率为59.79%,而对照组只有19.17%(P<0.01)。10μmol/L的Rg1实验组囊胚发育率为17.82%,也明显高于对照组1.87%(P<0.01)。结论 Rg1可提高KM小鼠1-细胞胚体外发育到桑葚胚及囊胚的比率,以10μmol/L浓度的Rg1效果最显著。     

ERα特异性抑制剂MPP降低小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E水平

目的观察雌激素受体(ERa)特异性抑制剂甲基哌啶吡唑(methyl-piperidino-pyrazole,MPP)对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡相关因子Nanog、cyclin D1和cyclin E表达水平的影响,阐明ERa对小鼠2-细胞胚G1/S期过渡的作用,为进一步探讨ERa在小鼠植入前胚合子基因组激活中的作用机制提供理论依据。方法收集昆明雌性小鼠与雄性小鼠交配所得的受精卵,分别置于无MPP的培养液和含20mmol/L MPP的培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光染色技术检测细胞内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平。结果免疫荧光染色结果显示,含20mmol/L MPP培养液培养的受精卵其体外发育2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E免疫反应性明显降低。结论 ERa可通过调控小鼠2-细胞胚内Nanog、cyclin D1和cyclin E水平,影响细胞从G1期到S期的过渡。     

多能性转录因子OCT4和SOX2在体外发育的小鼠2-细胞胚胎的表达与定位

为探讨多能性转录因子OCT4和SOX2在昆明小鼠(Mus musculus)2-细胞胚胎发育过程中与2-细胞胚胎阻滞发生的相关性,本研究应用实时荧光定量PCR技术检测了小鼠卵母细胞及在M16培养液中培养的不同发育阶段体外受精胚Oct4和Sox2基因的表达,并利用实时荧光定量PCR和免疫荧光技术比较了2-细胞胚、2-细胞阻滞胚和4-细胞胚的OCT4和SOX2的表达与定位。采用ANOVA对实验所得的数据进行分析,P0.05被认为是具有显著性差异。研究结果显示,2-细胞胚只有24.8%发育成4-细胞胚,75.2%的2-细胞胚发生了阻滞。Sox2和Oct4的m RNA在MⅡ期卵母细胞、原核胚、2-细胞胚、4-细胞胚、桑椹胚和囊胚中都有表达。Oct4 m RNA的表达水平在4-细胞胚显著高于2-细胞胚和2-细胞阻滞胚(P0.05),Sox2 m RNA的表达水平在2-细胞胚显著高于2-细胞阻滞胚和4-细胞胚(P0.05),而后两者之间没有差异(P0.05)。OCT4蛋白在2-细胞胚和4-细胞胚中与核共定位,但在2-细胞阻滞胚中弥散存在于胞质中。SOX2蛋白在以上3类胚胎中始终定位于细胞核。上述结果提示,转录因子OCT4和SOX2的表达和定位与小鼠2-细胞胚胎发育阻滞相关,母源性SOX2表达的维持对胚胎合子基因组激活(ZGA)的发生具有重要作用,母源性OCT4的异常定位可能影响了合子基因组激活相关基因的激活,而合子中Oct4的表达影响合子基因组激活后胚胎的发育。     

遗传背景对小鼠四倍体胚胎发育的影响

不同遗传背景的小鼠2-细胞期胚胎经过电融合后,胚胎的融合效率和四倍体胚胎的发育能力存在着一定的差异。本试验采用C57(C57×C57)、ICR(ICR×ICR)、BALB/c(BALB/c×BALB/c)、B6D2F2(B6D2F1×B6D2F1)、B6C3D2F2(B6C3F1×B6D2F1)品系的二倍体2-细胞期胚胎在相同的条件下经过电融合处理,结果表明:小鼠四倍体胚胎的获得效率受小鼠遗传背景的影响,远交系小鼠胚胎B6D2F2和B6C3D2F2的融合率显著高于近交系C57,ICR和BALB/c(P<0.05);四倍体胚胎在体外的发育情况也受其遗传背景的影响,在桑椹胚发育率和囊胚发育率上B6D2F2和B6C3D2F2品系的四倍体胚胎都显著高于C57和BALB/c品系的四倍体胚胎(P<0.05);杂合和纯系遗传背景的小鼠四倍体胚胎囊胚细胞数目相比具有显著差异(P<0.05或P<0.01);不同遗传背景的小鼠四倍体胚胎着床率间不存在显著差异(P>0.05);杂合背景的小鼠四倍体胚胎得到5只发育至13.5dpc(dayspostcoitum,dpc)的胎儿,纯合背景的小鼠四倍体胚胎得到0只发育至11dpc的胎儿。     

两种2-细胞鼠胚体外培养方法比较

目的应用鼠胚质控中的小鼠胚胎体外培养模型,探讨两种胚胎培养方式（四孔皿与微滴法）在单胚观察时间上的差异以及对2-细胞鼠胚体外发育潜能的影响。方法取6-8周龄的昆明白雌性小鼠。采用HMG10IU促排卵,48 h后注射HCG 10IU促卵泡成熟,取形态正常的2-细胞鼠胚。每5-10个胚胎培养在含500μL培养基的四孔皿中（A组）,或单个胚胎接种在含50μL的培养微滴中（B组）。培养后,每隔24 h在倒置显微镜下观察一次,计算单胚观察时间,并检测24 h时的≥4细胞胚形成率、48 h的融合胚形成率7、2 h的囊胚与扩张囊胚形成率、96 h囊胚孵化率。结果两种培养方式于同一试验条件下分别试验5次,A组培养83个胚胎,B组培养69个2-细胞鼠胚。在每一个观察点上,微滴培养的单胚观察时间远超过四孔皿培养（P〈0.001）。但两组各时间点的胚胎发育率相似,无显著差异（P〉0.05）。结论尽管微滴单胚培养方式的胚胎暴露培养箱外时间长,但与四孔皿多胚培养方式比较,两者间2-细胞鼠胚的体外发育潜能相似。     

通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的研究

本研究以羔羊卵巢母细胞为材料,把体外受精技术应用到绒山羊育种工作中,观察了羔羊体外受精卵的体外发育及移植产羔的效果,以便探讨通过体外受精技术缩短绒山羊育种周期的技术途径。对406 枚羔羊体外受精卵用M199 hcG、M199 LH 和M199 hcG EGF三种培养基进行体外发育培养。结果是,2～4 细胞期胚的发育率平均分别为40-0 % 、43-6 % 和49-6 % ;桑椹胚和囊胚的发育率平均分别为17-5 % 、15-8 % 和18-8 % 。将49 枚F1 代羔羊2～8 细胞期胚移植给31 只受体母羊,结果有11 只妊娠(35-5 % ) 并产羔12 只(F2 代) ;将24 枚F2 代羔羊2～4 细胞期胚移植给15 只受体母羊,结果有2 只妊娠(13-3 % ) 并产F3 代羔羊2 只。     

牛体外受精卵在两种共同培养系统中发育的研究

为了使牛体外受精卵能通过体外早期发育阻滞期,我们建立了卵丘细胞单层(A)和输卵管上皮单层(B)两种共同培养系统。A1共同培养实验是在本实验室进行的,A2和B共同培养实验均在日本岗山大学农学部动物繁殖学研究室进行,牛输卵管组织的分离使用0.76％EDTA—PBS溶液,共同培养系统均使用含10％小牛血清的TCM—199(Earle's salts)作为培养液。培养的卵泡卵母细胞体外成熟率为100％,体外受精率为99—100％。在A1共同培养实验中,越过阻滞期发育到16—细胞以上的胚胎占卵裂胚的35.7％,与A2共同培养实验中越过阻滞期的发育率(40.1％)无显著差异(P<0.05)。A1和A2共同培养实验,在卵裂基础上得到的桑椹胚和囊胚发育率分别为23.7％和27.9％。每百枚培养的卵母细胞,在A1共同培养实验中可获得桑椹胚和囊胚15.1枚,在A2共同培养实验中可获桑椹胚和囊胚的20.5枚。B共同培养实验中桑椹胚和囊胚发育率为54.1％,显著高于A1或A2共同培养实验的相应发育率(P<0.001),使用B共同培养系统每百枚培养的卵母细胞可以获得37枚桑椹胚和囊胚。     

用小鼠血液淋巴细胞构建核移植重构胚的研究

本实验用小鼠血液淋巴细胞为核供体进行了核移植研究。用淋巴细胞分离液(比重1．088)分离出小鼠血液中的淋巴细胞,直接用作核移植供体细胞,采用胞质内注射法成功构建的重构胚经常规培养2h后,SrCl2激活处理6h,然后添加mM16培养液和小鼠输卵管上皮细胞饲养层共培养。把发育至早期囊胚阶段的重构胚转移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,添加ES细胞培养液继续培养。对孵化出的内细胞团进行消化,然后接种培养。结果显示,小鼠血液淋巴细胞可以支持体细胞核移植重构胚的发育,核移植重构胚2-细胞率41．03％(128／312),桑葚胚和囊胚发育率分别为9．29％(29／312),1．92％(6／312)。重构囊胚在小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上分离出2个内细胞团,分离率为0．64％(2／312)。实验证实利用小鼠血液淋巴细胞进行体细胞核移植是可行的,可用于深入研究。     

模拟微重力环境对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响（简报）

In order to investigate the development of Kunming mouse preimplantation embryos cultured in vitro under simulated microgravtiy, one-cell and 4-cell embryos of Kunming mouse (Fertilization In Situ) were cultured in CZB or KSOM media under simulated microgravity or normal gravity environment respectively. The results showed that under normal gravity, the percentage of passing 2-cell development block embryos was not different in CZB with in KSOM, but the percentage of blastocysts was lower in CZB than that in KSOM significantly. The percentages of passing 2-cell development block embryos and blastocysts in CZB or KSOM were lower under simulated microgravity than those under normal gravity. It is suggested that the frequency of early embryonic lethality is possibly increased by simulated microgravity.     

模拟微重力环境对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响

90年代初,美国航空航天局(NASA)设计研制出一种转壁式生物反应器(Rotating Wall Vessel Bioreactor,RWVB)。采用RWVB进行基地试验时,意外地发现离体细胞在RWVB中呈现高密度聚集,并形成较大的组织样结构。RWVB的核心结构是由两个同心圆柱体构成的旋转培养装置。将细胞与培养液置入内、外圆柱体之间,整个装置绕水平纵轴旋转,使培养物长时间保持悬浮状态。由于在旋转过程中     

不同冷冻保护剂对早期卵裂期小鼠胚胎冷冻后成活率和发育的影响

为了评价利用不同冷冻保护剂冷冻早期卵裂期胚胎的效果,用小鼠为实验动物,采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术,比较丙二醇、二甲基亚砜和甘油作冷冻保护剂对小鼠2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎冷冻后胚胎存活率和囊胚形成率的影响。发现以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂冷冻4-细胞、8-细胞胚胎,解冻后胚胎成活率和囊胚形成率显著高于以二甲基亚砜或甘油为冷冻保护剂。结果表明,丙二醇是一种冷冻早期卵裂期小鼠胚胎有效的冷冻保护剂。     

Involvement of LIMK1/2 in actin assembly during mouse embryo development

LIMKs (LIMK1 and LIMK2) are serine/threonine protein kinases that involve in various cellular activities such as cell migration, morphogenesis and cytokinesis. However, its roles during mammalian early embryo development are still unclear. In the present study, we disrupted LIMK1/2 activity to explore the functions of LIMK1/2 during mouse early embryo development. We found that p-LIMK1/2 mainly located at the cortex of each blastomeres from 2-cell to 8-cell stage, and p-LIMK1/2 also expressed at morula and blastocyst stage in mouse embryos. Inhibition of LIMK1/2 activity by LIMKi 3 (BMS-5) at the zygote stage caused the failure of embryo early cleavage, and the disruption of LIMK1/2 activity at 8-cell stage caused the defects of embryo compaction and blastocyst formation. Fluorescence staining and intensity analysis results demonstrated that the inhibition of LIMK1/2 activity caused aberrant cortex actin expression and the decrease of phosphorylated cofilin in mouse embryos. Taken together, we identified LIMK1/2 as an important regulator for cofilin phosphorylation and actin assembly during mouse early embryo development.     

密闭培养条件下小鼠早期胚胎Igf2/H19印迹调控区甲基化状态分析

胚胎密闭培养是空间胚胎发育研究的基本条件.本文主要研究密闭培养条件对小鼠早期胚胎发育过程中印迹基因Igf2/H19的印迹调控区(ICR)甲基化水平的影响.应用亚硫酸氢盐测序法(BSP)分析小鼠2-细胞胚胎在密闭条件下分别培养24h、48h和72h后,相对应的发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平,以常规体外培养和体内发育的各阶段胚胎为对照.结果显示,密闭培养条件下,小鼠8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚的Igf2/H19的ICR甲基化水平都低于常规体外培养的结果,且更明显低于体内发育的结果;同时发现,小鼠8-细胞胚胎密闭培养时,Igf2/H19的ICR甲基化水平最低.由此可见,密闭培养会引起小鼠植入前各发育阶段胚胎Igf2/H19的ICR甲基化水平降低,并证明Igf2/H19的ICR甲基化水平可以作为监测哺乳动物早期胚胎发育状况的分子指标.     

Development of reconstituted mouse embryos produced from the cytoplast of bisected oocytes or pronuclear-stage embryos and single blastomeres of 2-cell stage embryos

The present study investigated the in vitro developmental potential of reconstituted mouse embryos produced from the cytoplast of pronuclear-stage embryos or oocytes and single blastomeres of 2-cell stage embryos by electrofusion. The cytoplast of pronuclear-stage embryos and oocytes were obtained by manual bisection with a fine glass needle under a dissecting microscope. The fusion rates of the reconstituted embryos produced from the cytoplast of oocytes and single blastomeres of 2-cell stage embryos (O-SB2: 38.1 and 41.5%) were significantly lower than those produced from the cytoplast of pronuclear-stage embryos and single blastomeres of 2-cell stage embryos (P-SB2: 91.2 and 97.6%; P<0.001). Reconstituted embryos were encapsulated in alginate gel and were cultured for 96 hours. Similarly, the cleavage and development rates to the blastocyst stage of O-SB2 (56.3, 61.2 and 2.0, 3.1%, respectively) were significantly lower than those of the P-SB2 (91.0, 91.2 and 18.6, 20.7%; respectively, P<0.05). The cleavage and development rates to the blastocyst stage (61.2 and 2.0%) of reconstituted embryos produced from single blastomeres of late 2-cell stage embryos and oocyte cytoplast improved after activation by ethanol treatment (76.1 and 21.7%). However, the use of single blastomeres of early 2-cell stage embryos as nuclear donors did not enhance the cleavage and development rates of the reconstituted embryos to the blastocyst stage.     

昆明小鼠体内发育早期胚胎葡萄糖代谢关键酶转录产物的分析

首次报道了昆明小鼠体内发育的早期胚胎1-细胞至桑椹期阶段葡萄糖代谢的3种关键酶-6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）、6-磷酸果糖激酶（PFK）和磷酸葡萄糖变位酶（PGM）的基因转录情况,其分别体现了磷酸戊糖、糖酵解、糖原的合成和分解等途径,根据G6PDH、PFK、PGM的cDNA序列分别设计和合成3套共6对内、外引物,采用巢式RT-PCR方法对其进行检测。结果表明：早期胚胎1-8细胞阶段均有G6PDH基因的转录,叠椹期胚胎不存在该基因的转录,说明早期胚胎1-8细胞阶段可能存在磷酸戊糖,而桑椹期则不存在;1-细胞至桑椹期均存在PFK基因的转录,说明该阶段的胚胎可能存在糖酵解代谢途径;1-细胞至桑椹期均不存在PGM基因的转录,说明该阶段的胚胎可能不存在糖原的合成与分解代谢途径。