文章摘要
丝状真菌里氏木霉中shRNA沉默红色荧光基因
ShRNAs Silencing DsRed Gene in the Filamentous Fungus Trichoderma reesei
  
DOI：doi:10.3969/j.issn.1005-7021.2016.04.002
中文关键词: RNA干扰  shRNA  红色荧光蛋白DsRed  里氏木霉
英文关键词: RNA interference  shRNA  DsRed  Trichoderma reesei
基金项目:国家自然科学基金项目（31070044）；深圳市科技基础研究发展计划(ZYC201105130092A)
作者单位
李洁璇 深圳大学生命科学与海洋学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060 
刘雯莉 深圳大学生命科学与海洋学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060 
梁智成 深圳市海洋生态与生物资源重点实验室 深圳大学，广东 深圳 518060 
王绍文 深圳市海洋生态与生物资源重点实验室 深圳大学，广东 深圳 518060 
梁秀怡 深圳大学生命科学与海洋学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060 
佘炜怡 深圳大学生命科学与海洋学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060 
刘刚 深圳大学生命科学与海洋学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060 
田生礼 深圳大学生命科学与海洋学院 深圳市微生物基因工程重点实验室，广东 深圳 518060 
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中文摘要:
      报道了在里氏木霉中建立的一种以红色荧光蛋白（DsRed）为报告基因的RNA干扰方法。首先，将构建的表达DsRed质粒pANRed1转化里氏木霉QM9414，得到抗潮霉素B抗性并能稳定表达DsRed的菌株DsRed-T.reesei。其次，以丙酮酸脱氢酶启动子Ppdc和纤维二糖水解酶I终止子cbh I为原件，克隆到载体pPHL上构建质粒pPHL-Ppdc-Tcbh1。根据DsRed基因序列设计特定的siRNA干扰序列和另一条无同源序列的siRNA作为阴性对照，克隆到载体pPHL-Ppdc-Tcbh1得到重组质粒。将其转化到DsRed-T.reesei中，用含有100 μg/mL潮霉素B和250 μg/mL腐草霉素的PDA平板筛选转化子。结果表明，约79%的转化子出现红色荧光沉默现象，其中一些转化子DsRed的表达几乎完全被抑制。荧光定量PCR和Western印迹分析显示DsRed基因的表达受到不同程度的下调。以上结果提示，在里氏木霉中可用此方法研究基因表达调控。
英文摘要:
      The establishment of a red fluorescent protein (DsRed) in Trichoderma reesei as a reporter gene of RNA interference method is reported in this paper. Firstly, a plasmid pANRed1 that expressed DsRed was constructed to transform T.reesei QM9414, and obtained a strain of DsRed-T.reesei that resist against hygromycin and could steadily express DsRed. Secondly, pyruvate decarboxylase promoter and the cellobiohydrolase I terminator cbh I as original parts was cloned into vector pPHL, and constructed pPHL-Ppdc-Tcbh1 plasmid. According to the sequence of DsRed gene, a specific siRNA interference sequence and another siRNA with nonhomogenous sequence siRNA as negative control, were cloned into vector pPHL-Ppdc-Tcbh1 and obtained recombinant plasmid. Transform it into DsRed-T.reesei， and screened transformant on PDA plate containing 100 μg/mL of hygromycin and 250 μg/mL of phleomycin. The results showed that approximately 79% of transformant appeared red fluorescence silence phenomenon, among them some transformant DsRed’s expressed almost total inhibition. Fluorescence quantitative PCR and Western blotting analysis showed that DsRed gene expression was down regulated to different degrees. The above results suggested that the study on gene expression in T.reesei could be regulated with this method.
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