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为了进一步了解2价Mg2+和1价Na+存在与否的情况下,多核酶系统对底物RNA的切割效率,构建了pGEM-Coat'A,pGEM-Coat'A196Rz质粒和pGEM-MDR1靶质粒,通过用SP6/T7转录试剂盒在体外转录RNA,在无细胞系统进行切割反应,反应产物通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,干胶、x光片曝光自显影,利用Image J生物图像分析软件分析,结果表明,多核酶系统的切割效率依赖于二价Mg2+的浓度,切割产物随Mg2+浓度的增加而增加,而且具有反应时间的依赖性,在Na+浓度低于200 mmol/L且单独存在时,没有切割产物生成,相反,在Na+和Mg2+共存时,表现出Na+抑制Mg2+诱导的切割活性,切割效率明显低于Mg2+单独存在时的结果.这些结果提示,在生理环境下,Mg2+对于多核酶系统对底物的切割反应是必需的,而Na+则不是. 相似文献
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目的:采用根癌农杆菌介导的转化方法实现丝状真菌里氏木霉的遗传转化,并优化转化条件.方法:构建含潮霉素抗性基因(hph)的双元载体pCAM-hph后,转化根癌农杆菌LBA4404获得转化菌株.将根癌农杆菌的转化菌株和里氏木霉的分生孢子共培养后在含100μg/mL潮霉素的抗性平板上筛选里氏木霉转化子,并采用PCR扩增和序列测定对转化子中的插入片段进行了分析.结果:使用根癌农杆菌介导的转化方法转化里氏木霉,每106个分生孢子可获得25.8个转化子.最佳的转化条件为:农杆菌初始浓度为OD660约为0.8,孢子数为106个,共培养时间为48h,pH为5.0~5.5,培养温度为28℃.结论:建立了根癌农杆菌介导的里氏木霉转化方法,并获得了最佳的转化条件. 相似文献
3.
血小板生成素的研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
自1994年DeSauvage等克隆出了人的血小板生成素(TPO)的CDNA后,对TPO的结构与功能的研究有了突破性的进展。本综述了近几年对TPO研究的最新献,较系统地介绍了TPO基本结构、CDNA、TOP受体的基因结构特征和TPO基因的染色体定位及生物学作用。 相似文献
4.
【背景】里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种比其他真菌小很多的多细胞真核微生物,在工业上受到广泛应用,而里氏木霉QM9414是目前研究最多基因产纤维素酶丰富的突变菌株。【目的】构建里氏木霉中组蛋白赖氨酸甲基化酶(Histone Lysine Methyltransferase)基因hkmt的siRNA沉默载体和过表达载体来降低或者增强hkmt在里氏木霉QM9414中的表达量,以分析其对里氏木霉纤维素代谢的调控作用。【方法】根据里氏木霉hkmt序列设计siRNA沉默片段并用反转录的方法获得过表达hkmt片段。将沉默片段和过表达片段克隆至里氏木霉组成型表达载体中,构建沉默hkmt的载体和过表达hkmt的载体,并将其转化里氏木霉QM9414。通过荧光显微镜观察重组菌的菌丝生长情况,此外对各重组菌进行纤维素酶的滤纸酶活性(Filter Paper Enzyme Activity,FPA)和羧甲基纤维素钠酶活性(Carboxymethyl Cellulose Enzyme Activity,CMCA)的测试;利用荧光定量PCR的方法检测hkmt、纤维素酶基因cbh1、egl1及木聚糖酶激活因子xyr1的表达量变化。【结果】通过使用荧光显微镜观察,发现沉默、过表达hkmt重组菌的菌丝形态均与出发菌株无明显差异。荧光定量PCR测定结果表明,沉默载体和过表达载体可以分别沉默和促进hkmt的表达。沉默hkmt重组菌株中FPA和CMC酶活力相比出发菌平均升高2.5倍。此外,纤维素酶相关基因和激活因子在沉默hkmt重组菌中的表达量均有所增加,但是在过表达hkmt重组菌株中以上相应指标均呈现相反的趋势。【结论】组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因表达产物负调控里氏木霉产纤维素酶基因的表达,这为提高里氏木霉产纤维素酶水平提供了参考,并为里氏木霉产纤维素酶的表观遗传调控研究提供了新的证据。 相似文献
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为了进一步了解2价Mg2+和1价Na+存在与否的情况下,多核酶系统对底物RNA的切割效率,构建了pGEM Coat′A,pGEM Coat′A196Rz 质粒和pGEM MDR1靶质粒.通过用SP6/T7转录试剂盒在体外转录RNA, 在无细胞系统进行切割反应,反应产物通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,干胶、X光片曝光自显影,利用Image J 生物图像分析软件分析. 结果表明,多核酶系统的切割效率依赖于二价Mg2+的浓度,切割产物随Mg2+浓度的增加而增加,而且具有反应时间的依赖性. 在Na+浓度低于200 mmol/L且单独存在时,没有切割产物生成.相反,在Na+和Mg2+共存时,表现出Na+抑制Mg2+诱导的切割活性,切割效率明显低于Mg2+单独存在时的结果.这些结果提示,在生理环境下,Mg2+对于多核酶系统对底物的切割反应是必需的,而Na+则不是. 相似文献
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人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母(Pichiapastoris)染色体上,获得遗传性稳定分泌表达株.利用酵母信号肽MFα,对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计,使天然人TPO成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功.表达产物经Western-blot进行分析,分子量约为66kD处蛋白条带可被TPO抗体识别;表达量约为0.1g/L;N端氨基酸序列分析结果与设计的一致;表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位(megakary-ocytecolonyformingunit,CFU-Meg)具有明显的刺激作用. 相似文献
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构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。 相似文献
8.
利用pSIREN-RetroQ载体构建了3个沉默多药耐药相关蛋白(MRP1)基因表达质粒pSI REN-siRNAs.并通过限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序鉴定,将截断MRP和全长MRP1 cDNA分别克隆到真核表达载体pEGFP-N2和pcDNA3.1中,产生了pEGFP-MRP1T和pcDNA-MRP1表达质粒.质粒pEGFP-MRP1T分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞沉默MRP1T-GFP靶基因,pSIREN-siRNA1作为阴性对照.荧光显微镜下显示结果表明,与pSIREN-siRNA1相比,pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3产生的siRNA能够有效沉默MRP1T-GFP融合蛋白的表达.为了沉默全长MRP1基因的表达,pcDNA-MRP1分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞.Western印迹和MTT分析表明,pSIREN-siRNA2和pSIREN- siRNA3能有效抑制190 kD MRP1在HEK293细胞中的表达,而pSIREN-siRNA1则不能.pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3能逆转MRP1转染HEK293细胞产生的多药耐药性.RNA二级结构预测结果分析表明,siRNA1靶序列mRNA局部自由能热动力参数ΔG低于siRNA2和siRNA3靶序列mRNA局部自由能热动力参数,siRNA1的GC含量和Tm值高于siRNA2和siRNA3.这些数据提示,siRNA和局部靶结构可能影响siRNA对MRP1 mRNA表达的沉默作用. 相似文献
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RNA干扰是真核生物中相对保守的一种基因特录后表达调控机制,它通过双链RNA介导细胞内mRNA发生特异性降解或翻译抑制,从而调控靶基因的表达.对丝状真菌中RNA压制和减数分裂沉默等现象的研究表明,与动、植物一样,丝状真菌中也存在RNA干扰现象.通过对RNA压制缺失突变株和减教分裂沉默缺失突变株的一系列分子生物学研究,获得了与之密切相关的一系列蛋白,而这些蛋白在结构和功能上与动、植物RNA干扰途径的蛋白高度相似,这些结果证明了丝状真菌中的RNA存在干扰现象.RNA干扰技术作为丝状真菌分子生物学研究或遗传改造的工具具有特殊的意义,因为丝状真菌具有多核和发生非同源重组频率高的特点,难以用基因敲除手段进行改造.系统地介绍丝状真菌中的RNA干扰途径以及使用RNA干扰对真菌进行遗传改造的方法. 相似文献
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[背景]里氏木霉(Trichoderma reesei)是木霉属中产纤维素酶最具代表性的真菌之一,表观遗传调控是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,组蛋白去乙酰化是其中一种。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责脱乙酰化,敲除去乙酰化酶基因可引起菌株孢子、菌丝及纤维素酶活性等的一系列改变。[目的]通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase,hdac)建立了里氏木霉hdac缺失突变株(T.reesei△hdac),以研究对纤维素酶基因表达的调控作用。[方法]利用Split-Maker技术构建了组蛋白去乙酰化酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T.reesei QM9414。经PCR及Southern blotting验证正确后,对突变体T.reesei△hdac连续7 d检测滤纸酶活(filter paper activity,AFP)、羧甲基纤维素钠酶活(carboxymethyl cellulase activity,CMCA),利用RT-qPCR检测纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达。[结果]突变体T.reesei△hdac两种酶活力均显著高于出发菌株,分别高出8.00、30.00 IU/mL。突变体T.reesei△hdac纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平分别为出发菌株T.reesei QM9414的6.50、6.01和4.51倍。[结论]里氏木霉中纤维素酶的基因表达明显受到组蛋白去乙酰化酶基因(hdac)的调控,这为研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶的影响提供了新的证据。 相似文献