| 里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达 |
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| 引用本文： | 白仁惠,张云博,王春迪,张斐洋,张喆,孙付保,张震宇.里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达[J].生物工程学报,2016,32(10):1381-1394. |
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| 作者姓名： | 白仁惠 张云博 王春迪 张斐洋 张喆 孙付保 张震宇 |
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| 作者单位： | 1 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2 南京林业大学 江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室，江苏 南京 210037,1 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122,1 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122,3 河南天冠企业集团有限公司 车用生物燃料技术国家重点实验室，河南 南阳 473000,3 河南天冠企业集团有限公司 车用生物燃料技术国家重点实验室，河南 南阳 473000,1 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122,1 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金 (No. 21176106)，车用生物燃料技术国家重点实验室开放基金 (No. KFKT2013010)，中国博士后科学基金 (No. 2015M571666)，江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室课题 (No. JSBGFC14006) 资助。 |
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| 摘 要： | 内切纤维素酶Cel5A缺乏是限制纤维素酶制剂高效酶解天然纤维素的关键因素。本文尝试构建高效表达里氏木霉Cel5A的毕赤酵母重组菌株以弥补目前Cel5A的天然分泌不足,通过基因密码子偏好性优化里氏木霉Cel5A基因和构建表达载体p PIC9K-eg2,并将其电转入毕赤酵母GS115以构建重组子,利用浓度梯度平板和摇瓶发酵筛选获得一株高产毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115-EGⅡ。重组酶的酶学性质分析显示,该酶分子量50 k Da、最适p H(p H 4.5)略有降低及最适反应温度为60℃,专一性地作用于非结晶纤维素,与天然里氏木霉Cel5A并无明显区别。通过摇瓶发酵的初步优化,该菌摇瓶培养条件:培养温度28℃、起始p H 5.0、接种量2%、每24 h添加甲醇1.5%(V/V)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐温80添加4 g/L,发酵192 h重组酶酶活达到24.0 U/m L。进一步上罐(5 L)发酵180 h,该重组酶Cel5A酶活高达270.9 U/m L,蛋白含量达到4.16 g/L。重组毕赤酵母P.pastoris GS115-EGⅡ是一株适合于外源表达Cel5A的工程菌,该重组酶可替代天然分泌Cel5A适用于当前酶基生物炼制模式下木质纤维素基质高效水解中。
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| 关 键 词： | 毕赤酵母GS115-EG Ⅱ，里氏木霉Cel5A基因，AOX1启动子，密码子偏好性，发酵优化，CMC酶活 |
| 收稿时间： | 1/9/2016 12:00:00 AM |
Gene optimization and efficient expression of Trichoderma reesei Cel5A in Pichia pastoris |
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| Renhui Bai,Yunbo Zhang,Chundi Wang,Feiyang Zhang,Zhe Zhang,Fubao Sun and Zhenyu Zhang.Gene optimization and efficient expression of Trichoderma reesei Cel5A in Pichia pastoris[J].Chinese Journal of Biotechnology,2016,32(10):1381-1394. |
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| Authors: | Renhui Bai Yunbo Zhang Chundi Wang Feiyang Zhang Zhe Zhang Fubao Sun and Zhenyu Zhang |
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| Institution: | 1 Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2 Jiangsu Key Laboratory of Biomass-based Green Fuels and Chemicals, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China,1 Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China,1 Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China,3 State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology, Henan Tianguan Group Co., Ltd, Nanyang 473000, Henan, China,3 State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology, Henan Tianguan Group Co., Ltd, Nanyang 473000, Henan, China,1 Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China and 1 Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China |
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