耐有机溶剂果糖苷酶的胞外表达、纯化和结晶

【目的】克隆表达一种Arthrobacter arilaitensis NJEM01来源的耐有机溶剂β-呋喃果糖苷酶(β-FFase)，纯化并进行结晶条件的研究。【方法】构建pelB信号肽与β-FFase融合表达质粒pET22b-pelB-bff，将其导入Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达，硫酸铵沉淀、DEAE阴离子交换色谱两步纯化重组蛋白，采用坐滴式气相扩散法对β-FFase进行结晶条件筛选和优化。【结果】构建重组质粒pET22b-pelB-bff，通过优化诱导表达条件，IPTG浓度0.1 mmol/L，诱导温度30 °C，诱导时间10 h，比活力高达108 U/mg，实现了果糖苷酶的胞外可溶性表达，纯化获得达到结晶纯度的β-FFase。结晶条件初筛和优化后获得可培养β-FFase晶体的条件为0.15 mol/L氯化钙，0.1 mol/L HEPES pH 6.7，26%聚乙二醇400。晶体衍射分辨率可以达到2.1 ?。【结论】高糖苷合成能力β-FFase表达纯化体系的构建和结晶条件的初步研究，为从结构生物学角度进一步研究果糖苷酶结构与功能的关系，定向进化提高糖苷酶转糖基活性奠定了基础。