逆转录法筛选mRNA靶点设计核酶对GPA的表达干预实验研究 |
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引用本文: | 付,辉,李菲菲,马,琼,付怀秀,崔玉芳,毛建平.逆转录法筛选mRNA靶点设计核酶对GPA的表达干预实验研究[J].中国生物工程杂志,2014,34(3):84-90. |
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作者姓名: | 付 辉 李菲菲 马 琼 付怀秀 崔玉芳 毛建平 |
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作者单位: | 1. 安徽医科大学 合肥 230032;
2. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850 |
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基金项目: | 国家自然科学基金资助项目(81072565,30271546) |
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摘 要: | 采用自行设计5’固定3’随机的文库对基因mRNA进行杂交用于逆转录反应以筛选mRNA的寡核苷酸结合靶点。对人I型跨膜糖蛋白-血型糖蛋白A (glycophorin A,GPA)的mRNA筛选了4个反义寡核苷酸可结合靶点,分别设计反义核酸(Antisense),分别加入mRNA中用RNase H验证各靶点的核酸结合和切割效率,最终确定2个高效结合和切割靶点。再设计Ribozyme,构建表达核酶(Ribozyme)质粒,利用慢病毒(Lentivirus)包装技术,感染人源红系白血病细胞株K562细胞,在细胞水平验证其下调GPA基因表达的效果,对转染细胞mRNA进行反转录和Real Time PCR分析mRNA表达水平,并在蛋白水平进行了Western Blot分析。结果表明文库结合逆转录方法筛选靶点设计的Ribozyme具有高效率下调膜受体表达的作用,GPA为I型跨膜糖蛋白,该实验为筛选mRNA靶点提供参考方法,并对膜受体表达干预有参考价值。
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关 键 词: | 血型糖蛋白A mRNA 靶点 Ribozyme 慢病毒 K562细胞 |
收稿时间: | 2014-01-21 |
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