重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定 |
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作者姓名: | 陈鑫 胡玥玥 徐鸿毅 王晓燕 邓锴 |
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作者单位: | 1 湖北医药学院附属人民医院 生殖医学中心,湖北 十堰 442000,1 湖北医药学院附属人民医院 生殖医学中心,湖北 十堰 442000,1 湖北医药学院附属人民医院 生殖医学中心,湖北 十堰 442000,2 湖北医药学院 基础医学院,湖北 十堰 442000,1 湖北医药学院附属人民医院 生殖医学中心,湖北 十堰 442000 |
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基金项目: | 国家自然科学基金 (No. 81401200),湖北省自然科学基金 (Nos. 2018CFB219,2013CFB479),湖北省教育厅科学技术研究项目 (Nos. B2015478,B2015493) 资助。 |
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摘 要: | PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。
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关 键 词: | PLCζ蛋白,昆虫细胞,杆状病毒表达系统,表达,纯化,鉴定 |
收稿时间: | 2018-12-06 |
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