银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立

银耳（Tremella fuciformis）属于高等担子菌，其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢．银耳芽孢单核，能像酵母那样快速生长且容易培养，具备优良外源基因表达宿主的特点．本研究以gpd—Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pG1g—gfp和pG1q—hph；设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定，结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同，在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg／mL；采用电击法把pG1q—hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞，假定转化子经MA筛选培养基筛选，结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为：STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1．0×10^8个／mL，电击体积200μL，表达质粒6μg，电击电压2．0kV／cm，电击后采用MB液体培养基静置预培养48h，转化率达277个／μg DNA．采用最佳电击参数把质粒pG1g—gfP和pG1g—hph按1：1共转化银耳芽孢，转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证，结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因，其共转化率为37．5％．这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光，表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达．