m6A去甲基化酶ALKBH5对大鼠S1PR3基因3′-非编码区双荧光素酶活性的影响

目的]明确m⁶A去甲基化酶ALKBH5对含S1PR3基因3′-非编码区(3′-UTR)双荧光素酶报告基因的调控作用。方法]以大鼠前额叶皮层脑区cDNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增S1PR3基因3′-UTR中含有m⁶A修饰位点的目的片段。利用重叠延伸PCR方法将三个靶序列GGACT、GGACT、AGACT中的第三位A突变为C,并将野生型S1PR3-3′-UTR片段和突变型S1PR3-mut-3′-UTR片段分别正向插入到pmiR-RB-Report^TM vector载体中。将pcDNA3.1-ALKBH5或空载体pcDNA3.1与野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别共转染PC12细胞，并检测荧光素酶活性。结果]成功构建了包含S1PR3基因3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-3′-UTR和突变型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-mut-3′-UTR。荧光素酶活性分析表明与空载体pcDNA3.1组相比，ALKBH5可显著降低野生型及突变型C1和C2报告载体荧光素酶的活性(P<...