| 连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座 |
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| 引用本文： | 邵振鲁,吴晓洁,林艳丽,熊福银,周艳荣,郑芸芸,李金钢,陈红星. 连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座[J]. 生物技术通讯, 2012, 0(5): 648-652,657 |
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| 作者姓名： | 邵振鲁 吴晓洁 林艳丽 熊福银 周艳荣 郑芸芸 李金钢 陈红星 |
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| 作者单位： | 1. 陕西师范大学 生命科学学院,陕西 西安 710062
2. 军事医学科学院 生物工程研究所,北京 100071 |
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| 摘 要： | 目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达。方法:采用连续3步缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3’端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9kb的mWAP基因5’端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起。结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的。结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法。
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| 关 键 词： | 细菌人工染色体 缺口修复 乳清酸蛋白 人溶菌酶 |
A Successive Three-Step Gap-Repair Method to Generate the mWAP-hLYZ Hybrid Gene Locus |
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| SHAO Zhen-Lu,WU Xiao-Jie,LIN Yan-Li,XIONG Fu-Yin,ZHOU Yan-Rong,ZHENG Yun-Yun,LI Jin-Gang,CHEN Hong-Xing. A Successive Three-Step Gap-Repair Method to Generate the mWAP-hLYZ Hybrid Gene Locus[J]. Letters in Biotechnology, 2012, 0(5): 648-652,657 |
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| Authors: | SHAO Zhen-Lu WU Xiao-Jie LIN Yan-Li XIONG Fu-Yin ZHOU Yan-Rong ZHENG Yun-Yun LI Jin-Gang CHEN Hong-Xing |
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| Affiliation: | 1.College of Life Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | bacterial artificial chromosome gap-repair whey acidic protein human lysozyme |
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