酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达 |
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作者姓名: | 朱甫祥 杨树德 刘泽隆 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 |
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作者单位: | 鲁东大学生命科学学院,烟台 264025;鲁东大学生命科学学院,烟台 264025;鲁东大学生命科学学院,烟台 264025;鲁东大学生命科学学院,烟台 264025;鲁东大学生命科学学院,烟台 264025;鲁东大学生命科学学院,烟台 264025 |
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基金项目: | 山东省自然科学基金(ZR2010CM061), 烟台市科技发展计划(2008152), 教育部留学回国人员科研启动基金(20071108)和鲁东大学科研基金(LZ20083305)资助项目 |
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摘 要: | 最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生.为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro1640~Ser1690的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响.用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接.结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用.而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接.另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接.为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据.
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关 键 词: | 凝血因子Ⅷ,酸性区3,分泌,蛋白质内含子,蛋白质反式剪接 |
收稿时间: | 2010-05-03 |
修稿时间: | 2010-07-29 |
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