Spectroscopic and staining studies of the ripening and overripening of aluminum hematoxylins

Summary Spectroscopic study of alum hematoxylins during the course of ripening, optimal status and final deterioration reveals an absorption spectrum with, maxima at about 560 m and at about 430 m. Early in the course of ripening the optical density ratio D560/D430 rises above 3.0 and this ratio is maintained at 3–4 through most of the useful life of the stain batch. In the final stage of deterioration the density at 430 m, rises and that at 560 fails, so that in late deterioration stages D560/D430 may fall as low as 0.5.As ripening progresses the density at 560 m, gradually rises so that when it reaches a value of 0.350 (1 cm cell, dilution 10 mg hematoxylin/1 liter) adequate staining is achieved. This level seems the same whether ripening be done by aeration, oxygen bubbling, sodium iodate or mercuric acetate. As ripening progresses further the D560 value may rise above 0.800 with air or iodate oxidation. Maximum values are usually lower with iodate oxidation. This finding tends to agree with the ancient impression that natural ripening provides the best alum hematoxylins.In agreement with the known variable hematein content (20–100%) of comercial hematoxylins the required doses of sodium iodate to reach initial satisfactory staining performance are variable and considerably lower than the precalculated stoichiometric amount for the complete conversion of fully reduced hematoxylin to hematein. The often quoted figure of 200 mg per gram hematoxylin agrees closely with the amount of potassium iodate which would be needed to convert 1 gm pure crystalline hematoxylin (M.W. 356.32) completely to hematein. It was found that 80 mg NaIO₃ per gram of reduced hematoxylin was adequate and for commercial samples 40–60 mg usually sufficed.The final overoxidation product of hematoxylin appears to be a complex mixture, not readily reduced back to hematein. Since 185.13 mg NaIO₃ is the theoretical amount for complete conversion to hematein of fully reduced hematoxylin, the amount of iodate required to attain maximum optical density at 560 m, is always less than that. The observed amounts range from 60 to 140 mg per gram of hematoxylin, and excesses apparently operate to convert hematein to further oxidation products.

---

Zusammenfassung Alaun-Hämatoxylin zeigt bei spektroskopischen Untersuchungen während der Reifung, der besten Färbungszeit und beim endgültigen Zerfall 2 Absorptionsmaxima. Sie liegen etwa bei 560 m und bei 430 m. Das Verhältnis der optischen Dichte D560/D430 steigt im Laufe der Reifung bereits früh auf 3,0 und bleibt während der Brauchbarkeit der Farblösung beständig zwischen 3,0 und 4,0. Im letzten Stadium des Zerfalls steigt die optische Dichte der Farblösung bei dem Maximum von 430 m während die von 560 m sinkt, so daß zu dieser Zeit D560/D430 bis auf 0,5 abfallen kann.Bei der Reifung steigt die optische Dichte langsam an. Wenn ein Wert von 0,350 (1 cm Zelle, 10 mg Hämatoxylin/Liter) erreicht ist, werden die Färbungen zufriedenstellend. Es scheint gleichgültig zu sein, ob die Reifung durch Luft, durch Hindurchblasen von Sauerstoff oder chemisch mittels Natriumjodat oder Quecksilberacetat erfolgt ist. Bei fortschreitender Reifung kann der D560-Wert bei Anwendung von Luft oder Jodat auf über 0,800 steigen. Die Maximalwerte sind bei Jodatoxydation jedoch stets etwas niedriger als bei Luftoxidation. Diese Befunde scheinen mit dem alten Eindruck übereinzustimmen, daß natürliche Reifung das beste Alaun-Hämatoxylin erzeugt.Da bekanntlich der Hämateingehalt der komerziellen Hämatoxiline stark schwankt (zwischen 20 und 100%), ist auch die zur Herstellung einer zufriedenstellenden Farblösung erforderliche Menge an jodsaurem Natrium sehr unterschiedlich. Sie ist beträchtlich niedriger als die im voraus berechnete stöchiometrische Menge für die vollständige Oxydation des voll reduzierten Hämatoxylins zu Hämatein. Die oft genannte Zahl von 200 mg NaJO₃ pro Gramm Hämatoxylin stimmt genau mit der Menge von KJO₃ überein, die benötigt wird, um 1 g kristallines Hämatoxylin (M.W. 356,52) in Hämatein zu verwandeln. Es wurde festgestellt, daß pro Gramm voll reduzierten Hämatoxylins 80 mg NaJ0₃ angemessen sind und daß gewöhnlich für Handelsware 40–60 mg genügen.Ein durch endgültige Überoxydation von Hämatoxylin entstandenes Produkt scheint eine komplexe Mischung zu sein, die nicht leicht wieder zu Hämatein reduziert werden kann. Da 185,13 mg NaJO₃ die theoretische Menge für die vollständige Oxydation von voll reduziertem Hämatoxylin zu Hämatein ist, ist die benötigte Menge von Jodat, um die höchste optische Dichte (D560) zu erreichen, immer etwas geringer als 185,13 mg. Die beobachteten Mengen liegen zwischen 60 und 140 mg pro Gramm Hämatoxylin. Überschüsse scheinen Hämatein in weitere Oxydierungsprodukte zu verwandeln.

---

---

Supported by a Student Fellowship of the Biological Stain Commission

---

Supported in part by Research Grant No. C-4816 National Cancer Institute, National Institutes of Health.