小鼠RNA干扰RelA基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法:针对小鼠Rel A基因序列,设计特异性的sh RNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞Rel A基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果:成功构建小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,Rel A基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论:成功构建了小鼠Rel A基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞Rel A基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。