| 重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定 |
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| 引用本文： | 白浩, 马端, 宋后燕, 莫炜, 顾银良, 孔德升, 郭泓珅,.重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定[J].生物工程学报,2004,20(6). |
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| 作者姓名： | 白浩 马端 宋后燕 莫炜 顾银良 孔德升 郭泓珅 |
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| 作者单位： | 复旦大学分子医学教育部重点实验室; 复旦大学分子医学教育部重点实验室 上海; |
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| 摘 要： | 人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI1-161仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒Pgem 3Zf(-) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI1-161 基因 ,构建表达质粒Ppic9k TFPI1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI1-161,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 20倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI1-161 表达为TFPI11-161 (2 4kD)和TFPI1-161 (27kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4.8和 4.9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1.4gTFPI1-161(2.4kD)和1.8gTFPI1-161 (2.7kD) ,其比活性分别达12880u/mg和12400u/mg.回收率达55%.经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测，重组FTPI1-161具有良好的抗凝及抑制Fxa活性的作用。为获得大量TFPI1-161提供了一种廉价高效的的蛋白表达纯化方式。为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。
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| 关 键 词： | 组织因子途径抑制物 TFPI1-161 表达 纯化 Pichia pastoris |
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