人DNA 拓扑异构酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及发酵条件优化 |
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作者姓名: | 杨国武 袁保红 何国平 戴欣 林永成 周世宁 |
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作者单位: | 1.中山大学生命科学学院生物化学系,广州 510275;2.深圳市计量质量检测研究院,深圳 518055;3.中山大学化学与化工学院天然产物研究室,广州 510275;4.香港理工大学应用生物与化学技术系, 香港 |
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摘 要: | 为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopo Ⅰ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母(SMD-hTopoI)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母(X33-hTopoI和KMhTopoI)更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY(pH 7.25),于20℃,每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液,SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力(43000u/mL),发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白,无糖基化修饰。
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关 键 词: | 人DNA拓扑异构酶I, 分泌表达, 优化, 毕赤酵母 |
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