副猪嗜血杆菌外膜囊泡激活caspase-11和NLRP3炎性体诱导炎性细胞因子IL-1β和IL-18分泌

【背景】副猪嗜血杆菌可引起多种炎性反应和较高死亡率，其致炎机制目前尚不清楚。【目的】探究副猪嗜血杆菌外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)诱导RAW264.7细胞caspase-11及NLRP3炎性体活化的功能，以及caspase-11在OMVs活化炎性体诱导炎性因子表达过程中的关键作用。【方法】副猪嗜血杆菌OMVs感染RAW264.7细胞，收集6、12和24h细胞，RT-PCR检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA的表达；收集感染后48 h细胞，Western blotting检测caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达。收集感染后6、12、24、48和72h细胞上清，ELISA检测interleukin(IL)-1β和IL-18表达水平；不同浓度OMVs(0、2.5、10、25、50和100μg/mL)感染RAW264.7细胞24h，ELISA检测上清中IL-1β和IL-18水平。构建caspase-11沉默RAW264.7细胞株，收集OMVs感染后12、24和48h细胞培养上清检测IL-1β和IL-18水平。【结果】Caspase-11 mRNA转录水平在OMVs感染6、12和24h均极显著高于对照组(P<0.01)；NLRP3 mRNA转录水平在感染后6、24h极显著高于对照组(P<0.01)；ASC mRNA转录水平在感染后12、24h显著低于对照组(P<0.05)；caspase-1 mRNA转录水平在感染后6、12和24h显著高于对照组(P<0.05)。Western blotting结果显示，与空白对照组相比，OMVs组caspase-11、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达均明显升高。OMVs感染RAW264.7细胞后12、24、48和72h，IL-1β表达量极显著高于对照组(P<0.01)，而且呈现时间依赖性升高，IL-18表达水平在感染后6、12、24、48和72h显著高于对照组(P<0.05)；不同浓度OMVs感染细胞时，OMVs对细胞的致炎作用呈现剂量依赖性增强。Caspase-11沉默后，IL-1β水平在感染后12、24和48h显著低于未沉默组；Caspase-11沉默组IL-18表达量在感染后24、48h均显著低于未沉默组(P<0.05)。【结论】副猪嗜血杆菌OMVs在副猪嗜血杆菌诱导的炎症反应中发挥重要作用，OMVs可诱导RAW264.7细胞caspase-11介导的非经典NLRP3炎性体信号通路活化。