四种常见猪肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

【背景】猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原，并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法，对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物，进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化，建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示，对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×10²、1.5×10³、1.6×10²和1.6×10²copies/μL；特异性试验结果显示，仅可检出本研究中的4种靶病毒，而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示，选取10⁸、10⁶和10⁴copies/μL 3个不同浓度的重组质粒作为模板，其他条件不变，分别进行5次重复试验，5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测，发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37%(19份)、6%(3份)、10%(5份)和25%(13份)。其中PEDV和PoRV混合感染2份(4%)，PEDV和TGEV混合感染2份(4%)，PEDV和PDCoV混合感染1份(2%)。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证，结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100%。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证，结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法，研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。

Establishment and clinical application of multiplex RT-PCR assay for four common porcine enteroviruses