| 通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株 |
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| 引用本文： | 翁文莲,宫晓倩,高波,方守国,王欢,钱琨,丁铲,廖瑛.通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株[J].病毒学报,2021,37(6):1376-1384. |
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| 作者姓名： | 翁文莲 宫晓倩 高波 方守国 王欢 钱琨 丁铲 廖瑛 |
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| 作者单位： | 中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;长江大学农学院/动物科学院,荆州434000;江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州大学,扬州225009;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州大学,扬州225009 |
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| 摘 要： | 传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属于γ属冠状病毒,其核酸内切酶nsp15(Non-structural protein 15)的功能尚未得到解析.为探讨nsp15在IBV感染和复制过程中的作用,本研究对nsp15的核酸内切酶活性中心H238进行突变,通过体外连接技术构建重组病毒rIBV-nsp15-H238A,并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定.方法 如下:将IBV Beaudette-R毒株的基因组分成5个片段克隆到质粒载体,并在每个片段加上BsaI或BsmBI限制性酶切位点.通过质粒载体进行扩增后,通过酶切获得cDNA片段,在体外连接成全长基因组cDNA,转录出全长基因组RNA,跟N的转录本一起电击转染到Vero细胞,拯救出重组病毒rIBV和rIBV-nsp15-H238A.利用空斑试验检测比较rIBV和rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度和空斑大小,鉴定nsp15核酸内切酶活性对IBV感染性的影响.结果 显示,rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度为2.7×106PFU/mL,比rIBV的病毒滴度(9.4×106PFU/mL)低3倍还多,且rIBV-nsp15-H238A空斑孔径远小于rIBV,说明rIBV-nsp15-H238A复制和扩散能力远低于rIBV.利用TCID50检测病毒的生长曲线,结果表明在感染后0～24h,rIBV-nsp15-H238A的生长曲线均低于rIBV.由此可见,IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对IBV的感染复制起着重要作用.本研究通过反向遗传操作构建nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒,为研究nsp15的功能提供了一个有力的工具.
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| 关 键 词： | 传染性支气管炎病毒(IBV) 体外连接 感染性cDNA克隆 rIBV rIBV-nsp15-H238A |
Construction of Infectious Bronchitis Virsus Endoribonucleasensp15 Defective Recombinant Virus by Reverse Genetic System |
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| WENG Wenlian,GONG Xiaoqian,GAO Bo,FANG Shouguo,WANG Huan,QIAN Kun,DING Chan,LIAO Ying.Construction of Infectious Bronchitis Virsus Endoribonucleasensp15 Defective Recombinant Virus by Reverse Genetic System[J].Chinese Journal of Virology,2021,37(6):1376-1384. |
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| Authors: | WENG Wenlian GONG Xiaoqian GAO Bo FANG Shouguo WANG Huan QIAN Kun DING Chan LIAO Ying |
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