| 基于易错PCR技术的红酵母D-氨基酸氧化酶的定向进化 |
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| 引用本文： | 孙晨,肖慈英,郭美锦,储炬,张嗣良.基于易错PCR技术的红酵母D-氨基酸氧化酶的定向进化[J].工业微生物,2014,44(4):52-58. |
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| 作者姓名： | 孙晨 肖慈英 郭美锦 储炬 张嗣良 |
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| 作者单位： | 孙晨 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237)； 肖慈英 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237)； 郭美锦 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237)； 储炬 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237)； 张嗣良 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237)； |
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| 摘 要： | 采用易错PCR技术对来源于红酵母Rhodotorula gracilis的D-氨基酸氧化酶基因(RgDAAO)进行突变,构建并优化了突变株文库;结合48深孔板的高通量筛选方法,获得突变株M3217,其V_(max)相对于野生型提高了16.8%。对测序结果进行分析,发现突变酶基因序列中有5处点突变,其中3处发生了氨基酸置换,分别为:D242V/Q253R/D304V。利用Swiss-Model对突变株M3217进行三维结构模拟,结果显示所有突变位点都不在催化活性中心的附近,特别是V304的位置在连接F5和F6两个β折叠股的长loop环上。推测D304V这一突变位点很可能增强了RgDAAO二聚体形态的稳定性,或是增强了与辅酶FAD的结合能力,从而间接提高了全酶的催化活力。
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| 关 键 词： | 易错PCR 定向进化 高通量筛选 红酵母D-氨基酸氧化酶 |
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