| 基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装 |
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| 引用本文： | 柳云帆,尉迟捷,王刚,田文洪,陆月,刘雪荣,董小岩,郑刚,沈炜,吴小兵,阮力.基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装[J].病毒学报,2011(3). |
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| 作者姓名： | 柳云帆 尉迟捷 王刚 田文洪 陆月 刘雪荣 董小岩 郑刚 沈炜 吴小兵 阮力 |
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| 作者单位： | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所;吉林大学生命科学学院;温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室;北京五加和分子医学研究所; |
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| 基金项目： | 创新性艾滋病疫苗的前期研究(2008ZX10001-012); 基因治疗药物关键技术(2009ZX09503-020)资助 |
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| 摘 要： | 本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red...
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| 关 键 词： | λ-Red重组酶 PCR打靶 腺病毒 Ⅳa2 |
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