限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析 |
| |
引用本文: | 方倩倩,陈浩,廖馨源,林忠辉.限制性核酸内切酶Asc I蛋白质的表达纯化、酶活测定及小角散射结构解析[J].中国生物化学与分子生物学报,2023(2):259-268. |
| |
作者姓名: | 方倩倩 陈浩 廖馨源 林忠辉 |
| |
作者单位: | 福州大学化学学院生物药光动力国家地方联合工程中心 |
| |
基金项目: | 国家自然科学基金(No.31971222)资助~~; |
| |
摘 要: | 限制-修饰系统(RMS)是细菌为了防御外来DNA入侵而进化产生的一种保护机制。RMS系统可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Asc I是一种Ⅱ型限制性核酸内切酶,能识别8-bp DNA基序。尽管Asc I已经被广泛应用于分子克隆研究中,然而目前尚无关于Asc I蛋白质的表达、纯化以及结构机制等方面的研究报道。本研究基于大肠杆菌重组表达体系建立了Asc I重组蛋白质的高效表达和纯化方法,从每升细菌培养物中可获得约2.5 mg纯度大于95%的Asc I蛋白质。进一步的酶学性质研究表明,Asc I酶切反应的最适温度是37℃,最适pH为7.5~8.5,反应依赖于Mg2+和Mn2+等二价金属离子。基于小角X射线散射(SAXS)分析技术,我们还建立了Asc I蛋白质及其与底物DNA复合物在溶液状态下的三维空间模型,并结合点突变对该模型进行了验证。总之,本研究对Asc I蛋白质的重组表达、纯化、酶活性质以及结构机制进行了比较系统地研究,为了解RMS系统的工作机制提供了结构基础,同时也为Asc I作为分子克隆工具酶的进一步开发和改造提供了理论依据。
|
关 键 词: | 限制性核酸内切酶 Asc I 表达纯化 酶学性质 小角散射 |
|
|