微小毛霉凝乳酶基因定点突变及其酶学性质

微小毛霉凝乳酶具有很高的凝乳酶活力,是牛凝乳酶的潜在替代品,但由于微小毛霉凝乳酶蛋白水解活力过高,不利于干酪生产应用,所以本研究探索利用定点突变技术对微小毛霉凝乳酶基因进行分子改造,降低其蛋白水解活力及热稳性,提高凝乳活力。结果表明,凝乳酶肽链第186位由甘氨酸(Gly)突变为天冬氨酸(Asp)(即G186D)后,突变子凝乳活力显著提高,热稳定性有所降低;13位点由谷氨酸(Glu)分别突变为天冬氨酸(Asp)和谷氨酰胺(Gln)(即E13D,E13Q)后,突变子蛋白水解活力明显降低,同时凝乳活力稍有降低;第101位点由甘氨酸(Ala)突变为苏氨酸(Thr)(即A101T),突变子凝乳活力稍有提高,水解活力及热稳定性没有明显变化。此外,双重突变子,即101位点和186位点同时突变的突变子(即A101T/G186D)表现型与186单位点突变相一致,凝乳活力显著提高,热稳定性显著降低;186位点和13位点同时突变的突变子G186D/E13D和G186D/E13Q与13位点单点突变相比,凝乳活力有所提高,水解活力显著降低。