谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶(GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶，谷氨酸棒杆菌S9114是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种，其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶，研究其辅酶组成，对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质，提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、EDTA的Tris-HCl缓冲液 (pH 7.5)洗涤，用French pressure cell press 破碎，离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用?KTA_100快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱(HIC)、G-200凝胶过滤柱层析得到纯化大约70倍的以NADPH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一，不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为188kD和32kD，表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHI U-3000 分光光度计利用NAD(P)H在340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford 方法进行，并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S9114中确实存在两种GDH，其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样，S9114可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢，以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。同时发现以NADPH为辅酶的GDH在280nm吸收很弱，在215nm吸收很强。说明此酶中酪氨酸、苯丙氨酸含量较低。