| 摘 要： | 目的:构建DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)磷酸化簇区域的酵母双杂交诱饵载体及针对该区域的单链抗体anti-DPK3-scFv的猎物蛋白的表达载体,并进行活性和相互作用鉴定。方法:应用PCR方法扩增DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并将它们分别克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7中,经酶切和测序鉴定正确后,用LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定诱饵蛋白和猎物蛋白的毒性和自激活活性,并通过酵母双杂交方法验证DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv的相互作用。结果:扩增出DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并分别将它们克隆至p GBKT7和p GADT7载体中,转化酵母细胞发现它们对酵母细胞的生长均无毒害作用,自激活活性分析显示诱饵质粒和猎物质粒均无自激活活性,并证实DNA-PKcs磷酸化簇区域能够与anti-DPK3-scFv在体外直接相互作用。结论:构建了DNA-PKcs磷酸化簇的诱饵质粒p GBKT7-DPC,为后续筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白奠定了实验基础。
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