Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究 |
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引用本文: | 耿介,王超男,李少华,丁红梅,李慧,黄皑雪,李洁,李达,白琛俊,张坦,董洁,邵宁生.Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究[J].生物技术通讯,2018(2). |
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作者姓名: | 耿介 王超男 李少华 丁红梅 李慧 黄皑雪 李洁 李达 白琛俊 张坦 董洁 邵宁生 |
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作者单位: | 军事医学研究院军事认知与脑科学研究所; |
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摘 要: | 目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。
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